イニシエーター蛋白による複製開始調節機構

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本研究はレプリコン特異的なイニシエーター蛋白が、如何にして細胞世代あたり一定の頻度で複製を開始するかを明らかにするものである。特に、プラスミドR6Kにおいて、イニシエーター蛋白による制御DNAの識別、結合、開始複製体の形成の機序について研究を進めた。1.イニシエーターπ蛋白の構造と機能相関。π蛋白遺伝子(pir)の欠失変異株および複製開始頻度を増減させる点突然変異株の機能と構造を解析した: in vitro複製系で、cop変異π蛋白は野性型蛋白より10倍近い複製能をもち、π蛋白の中央部が複製制御に授ることを証明した。さらに、π蛋白生合成の自動制御への効果を検索し、本蛋白の制御DNAへの主要結合ドメインがC末側に存在することを確定した。2.R6Kの複製開始反応におけるDnaAおよびπ蛋白の機能。複製開始複合体の構築とその機能を解析するために、宿主複製蛋白の要求性を検討したところ、DnaB、polIII、Ssb蛋白などに加えて、新たに、DnaA蛋白が必須であるが判明した。(1) in vivo複製系で、oriα、β、γのいずれからの複製もdnaA^-株では全く起らず、ori領域のDnaA boxを変異させると、野性株でも複製できない。(2) in vitro複製系で、DnaA蛋白の要求性が確定された。(3) しかし、DnaA蛋白濃度はR6Kの複製開始頻度の決定に強くは関与しない。(4)π蛋白はR6KDNAテンプレートあたり、約50個のダイマー分子の時、最高のDNA合成活性を示し、これより多いと複製が阻害された。このように、π蛋白量(とその識別配列量)により複製開始が巧妙に制御されていることが明らかにされた。さらに、π蛋白量に依存したin vitro複製系が動くことが示され、調節機能を持つ複製開始再構成系の構築に多大の展望をもつことができる。