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多複製開始点をもつゲノムの複製開始と制御の分子機構

具有多个复制起点的基因组中复制起始和控制的分子机制

基本信息

批准号：
04256212
负责人：
犬塚學
金额：
$ 1.28万
依托单位：
福井医科大学
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1992
资助国家：
日本
起止时间：
1992 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

原核生物レプリコンは大部分、単一の複製開始点(ori)でDNA-蛋白複合体(イニシオソーム)を構築し、複製を開始する。一方、真核生物のゲノムでは多くのoriクラスターから始まるが、その分子機構は全く分かっていない。そこで、本研究では、5.5kb内にoriα,β,γの3個の複製開始点をもつプラスミドR6Kをモデルレプリコンとして選び、マルティオリジンからの複製開始が如何に起こり、どのように制御されているかを明かにしたい。本年度は、R6Kの3つのoriの活性化に必要なシス、トランスエレメントをさらに精査するために、π蛋白存在下で複製できる一個のみのoriをもったoriα,β,およびγプラスミドを構築し、その特性を解析し、次のような興味ある結果を得た。1.oriγ活性におけるDnaA-box(I)配列は、π蛋白結合配列(7iterons)との距離が必要であった。なお、ゲルシフトアッセイにより、DnaA蛋白はこのDnaA-box(I)配列よりも、全てのori活性に必須のbox(II)により強い親和性をもつことが明らかになった。2.oriβプラスミドの複製はπ蛋白をトランスに供給すると阻害され、本蛋白による複製制御が示された。3.レプリコン活性はssiBを含むoriα領域と7iterons領域との間のスペーサー配列を必要とすることが明らかになった。特に、このスペーサーを欠失したプラスミドは、IHF蛋白によるDNA bendingがないと複製できないことより、π蛋白を介しての両領域間でDNA loopingがoriαの活性化に必須であることを示唆している。今後、これらの成果を踏まえて、π蛋白やDnaA蛋白がiteronsやDnaA-boxesに結合後、3〜2kbも離れたoriαまたはoriβ領域とのDNA loopを形成してから、どのように各々のoriでイニシオソームを構築し、primer合成へと進行するかについて、in vivo,in vitro DNA複製系を用いて、解明していきたい。

Prokaryotes have most of the replication initiation points, and the DNA-protein complex is constructed and replicated. The molecular structure of eukaryotic organisms is completely different from that of other organisms. In this study, three replication start points (α,β,γ) within 5.5 kb were identified. The first three replication start points (R6K) were identified. This year, we have obtained the results of detailed investigation on the necessary factors for activation of R6K and its 3-component ori in the presence of π protein, and replication of a 3-component ori in the presence of α,β, γ-component ori in the presence of π protein. 1. ORI γ-activity is necessary for DnaA-box(I) alignment and π-protein binding alignment. DnaA-box(I) alignment is required for all ORI activities, and box(II) is required for strong affinity. 2. ORI β-protein replication is inhibited by protein supply and replication inhibition. 3. It is clear that the siB activity includes the need for space allocation between the Tori α domain and the 7iterons domain. In particular, DNA binding between IHF protein and DNA binding between IHF protein. In the future, after the combination of π protein and DnaA protein with iterons and DnaA-boxes, the DNA loop of 3 ~ 2kb DNA fragment α and β domain will be formed, and the DNA fragment will be constructed, primer synthesis will be carried out, and the DNA replication system will be used in vivo.