好熱菌PS3のH^+(Na^+)/アラニンシンポーターの分子機構

嗜热细菌PS3中H^+(Na^+)/丙氨酸同向转运体的分子机制

基本信息

  • 批准号:
    05252230
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 1.02万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    日本
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
  • 财政年份:
    1993
  • 资助国家:
    日本
  • 起止时间:
    1993 至 无数据
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

好熱菌PS3のアラニン能動輸送体(ACP)は分子量約42,500Daの単一ポリペプチドからなり、H^+あるいはNa^+の電気化学的ポテンシャルによって駆動されるH^+(Na^+)/基質(アラニン、グリシン、セリン)シンポーターである。昨年までにACP遺伝子をクローニングし、その全構造を決定した。今回は大腸菌のアラニン、グリシン輸送欠損株RM1を用いてACPの機能発現を試みた。これまでにクローニングされているACP遺伝子のORFとその上流120bpを含むHindIII-SalIの約1.5KbpフラグメントをpUC119に組み込んだプラスミドを作製し、大腸菌アラニン、グリシン輸送欠損株RM1(MacLeod博士より分与)に導入し、^<14>C-アラニンあるいは^<14>Cグリシン輸送活性を測定したがいずれも活性は見られなかった。したがって、ACP遺伝子のプロモーター領域はこのフラグメントには含まれていないことが考えられた。そこでこのプロモーター領域を検索するため、HindIPI-EcoRIの約500bpのフラグメントをプローブとして上流約2.2KbpをクローニングしACP遺伝子につなげたのちにベクターpBR322へ組み込んだプラスミド(pAC5629)を作製し上記RM1に導入し(RM1(pAC5629))、この株について^<14>C-アラニンあるいは^<14>C-グリシン輸送活性を測定したところ非常に強い輸送活性を示し、少なくともACP遺伝子ORFの上流2.2Kbp部分にプロモーター活性が存在することが明らかになった。また、RM1(pAC5629)におけるACPタンパク質の発現は抗ACPポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティングにより確認された。また、輸送の速度論的解析を行ったところ、L-アラニンに対するKtは11muM、グリシンに対するKtは6muMとなり、これらはいずれも精製ACPのプロテオリポソーム再構成系でのKt値とよく一致した。さらに、対照として用いた大腸菌K12株の^<14>C-グリシンの輸送活性の至適温度35℃付近であったが、RM1(pAC5629)株においては至適温度は45℃付近と明らかな好熱性を示した。このようにACP遺伝子ORFの上流2.2Kbpの領域にプロモーターが存在することが明らかとなったが、この部分の塩基配列を調べたところ藻Anabena sp.の挿入配列(Insertion sequence、IS)と非常に高いホモロジースコアを示し、しかもACPはこのISを含まなければほとんど発現しないことが解った。このことはACPとISはポリシストロニックな転写、すなわちオペロンを形成していることを示唆しており、現在プロモーター領域の決定とISの役割について解析を進めている。
The active transporter (ACP) of PS3 has a molecular weight of about 42,500 Da and a molecular weight of about 42,500 Da. It has a molecular weight of about 42,500 Da. It has a molecular weight of about 42,500 Da. It has a molecular weight of about 42,500 Da. It has a molecular weight of about 42,500 Da. Last year, the ACP gene was selected for the first time, and the whole structure was determined. This paper attempts to detect the functional development of ACP in Escherichia coli by using the strain RM1. The upstream 120bp of ACP gene ORF and pUC119 containing HindIII-SalI were introduced into E. coli, and the transmission-deficient strain RM1 (Dr. MacLeod) was introduced into E. coli. The transmission-deficient strain RM1 (Dr. MacLeod) was introduced into E. coli and the transmission-deficient strain RM1 (Dr. MacLeod<14>)<14>. However, the ACP heritage field has become a hot topic in this field. HindIPI-EcoRI is about 500bp in length and about 2.2 kbp in length. It is a 322 bp long chain of DNA.(pAC5629) Control and entry of RM1 (RM1 (pAC5629)), the plant is very strong in the transport activity of the determination of the C-transport activity. The <14><14>upstream 2.2Kbp portion of the ACP gene ORF is active. For example, RM1(pAC5629) can be used to identify the ACP component. Kt = 11muM, Kt = 6muM The <14>optimum temperature for the transport activity of E. coli K12 strain was 35℃, and the optimum temperature for the transport activity of E. coli RM1 (pAC5629) strain was 45℃. The upstream 2.2Kbp domain of the ACP gene ORF IS very high in the insertion sequence (IS) of Anabena sp., and the upstream 2.2Kbp domain of ACP gene ORF is very high in the Insertion sequence (IS) of Anabena sp. The ACP and IS are divided into two parts: the first part is divided into two parts: the second part is divided into three parts: the third part is divided into three parts: the fourth part is divided into three parts: the fourth part is divided into four parts: the fourth part is divided into three parts: the fourth part is divided into four parts: the fourth part is divided into

项目成果

期刊论文数量(16)
专著数量(0)
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专利数量(0)
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平田肇: "日本膜学会編 〓膜学実験シリーズ第1巻生体膜編〓第3章生体膜の機能的再構成平面膜" 共立出版, 10 (1993)
Hajime Hirata:“日本膜学会编 - 膜科学实验系列第 1 卷生物膜版 - 第 3 章生物膜平面膜的功能重建” Kyoritsu Shuppan,10 (1993)
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    0
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Muneyuki,E.: "Direct Transmembraneous Reconstitution of Bacteriorhodopsin into Planar Phospholipid Bilayers." Biochim.Biophys.Acta. 1183. 171-179 (1993)
Muneyuki,E.:“细菌视紫红质直接跨膜重建为平面磷脂双层。”
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    0
  • 作者:
  • 通讯作者:
平田肇: "日本膜学会編 〓膜学実験シリーズ第1巻生体膜編〓第2章生体膜構成成分の分離・分析法アミノ酸キャリヤー" 共立出版, 6 (1993)
Hajime Hirata:“日本膜学会编-膜科学实验系列第1卷生物膜版-第2章生物膜成分氨基酸载体的分离和分析”Kyoritsu Shuppan,6(1993)
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Muneyuki,E.: "Inhibitory Effect of NaN3 on the FoF1 ATPase of Submitochondrial Particles as related to Nucleotide Binding." Biochim.Biophys.Acta. 1144. 62-68 (1993)
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