Na^+/H^+駆動型アミノ酸トランスポーターの構造・機能協関

Na^+/H^+驱动的氨基酸转运蛋白的结构和功能关系

• 批准号: 07276233
• 负责人: 平田 肇
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: Himeji Institute of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07276233/
• 关键词: アミノ酸トランスポーター; 融合タンパク質; 大量発現; 好熱菌; プロテオリポソーム

中等度好熱菌PS3細胞質膜に存在する二次性能動輸送系の一つ、アラニン能動輸送タンパク質(ACP)はNa^+あるいはH^+とアラニン、グリシンなど小型中性アミノ酸の共輸送を仲介する膜タンパク質である。本研究はこのタンパク質の構造と機能の協関を物理化学的手法によって解明することを目標とし、そのためにこのタンパク質の大量発現系を確立することを目的とした。これまでに、ACPをコードする遺伝子(acp遺伝子)がクローニングされ、大腸菌機能変異株を用いた機能発現系が確立されているので、本年度はまずACP発現に適した発現ベクターを選択し、大腸菌内で組み換えタンパク質を大量発現する系について検討を行った。その結果、ACPとマルトース結合タンパク質(MBP)との融合タンパク質(MBP-ACP)を発現するようなプラスミドがACPの大量発現系構築に最も都合の良い発現ベクターであることが分かったのでこれを用いて解析を進めた。MBP-ACP融合遺伝子を大腸菌アラニン、グリシン輸送能欠損株(RM1株)に導入しその^<14>C-グリシン輸送能を測定したところ、興味深いことにMBP-ACPの融合タンパク質の状態で輸送活性を持つことが分かった。この融合タンパク質は基準特異性やKt値についてはACPと変わらなかったが、本来は高温(45〜50°C)にあるべき輸送活性の温度依存性は失われていた。この融合タンパク質の発現は細胞毒性を与えるので、これを克服し大量に発現タンパク質を得る条件を探索し全膜タンパク質の約25%を越える量の発現条件を確立することができた。大量に発現したタンパク質を精製し、輸送活性を指標としたプロテオリポソームへの再構成実験で調べたが、現時点ではnative ACPに見られる活性の1%以下の活性しか見られず、種々のデータからかなり強固な封入体として存在していることが予想された。

A secondary kinetic transport system exists in the plasma membrane of PS3 cells of moderate thermophilic bacteria. It mediates the co-transport of Na^+, H^+, ACP and small neutral acids. In this study, the physical and chemical methods for understanding the relationship between structure and function of these substances were used to establish a large number of occurrence systems. This year, the ACP gene (acp gene) has been identified and the functional development system of E. coli functional variant strains has been established. This year, the selection of ACP gene and the system of large number of E. coli gene has been discussed. As a result, ACP and MBP are combined with MBP-ACP to develop the ACP's mass development system. The MBP-ACP fusion gene was introduced into E. coli strain (RM1 strain), and <14>the transport activity of MBP-ACP fusion gene was measured. This fusion is characterized by a high temperature (45 ~ 50°C) and a high temperature dependence of the transport activity. The conditions for the development of fusion protein and cytotoxicity were explored and the conditions for the development of fusion protein were established. About 25% of fusion protein was developed. A large number of products have been found, such as quality refinement, transport activity, index, recombination, modulation, current point, activity of less than 1% of native ACP, strong encapsulation, and presence of strong encapsulation.

项目成果

Shinomiya,H.: "Complete Primary Structure and Phosphorylation Site of the 65 kDa Macrophage Protein Phosphorylated by Stimulation with Bacterial Lipopolysaccharide." J Immunol.154. 3471-3478 (1995)

Shinomiya,H.：“通过细菌脂多糖刺激磷酸化的 65 kDa 巨噬细胞蛋白的完整一级结构和磷酸化位点。”

Murai,N.: "A novel insertion sequence(IS)-like element of the thermophilic bacterium PS3 promotes expression of the alanine carrier protein-encoding gene." Gene. 163. 103-107 (1995)

Murai,N.：“嗜热细菌 PS3 的一种新型插入序列 (IS) 样元件可促进丙氨酸载体蛋白编码基因的表达。”

平田 肇: "日本生物物理学会編集「生体膜」第3章イオンポンプ" 吉岡書店, 81-99 (1996)

Hajime Hirata：《生物膜第 3 章离子泵》，日本生物物理学会编辑，吉冈书店，81-99（1996）