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好熱菌PS3のH^+(Na^+)/アラニンシンポーターの分子機構

嗜热细菌PS3中H^+(Na^+)/丙氨酸同向转运体的分子机制

基本信息

批准号：
04266218
负责人：
平田肇
金额：
$ 0.96万
依托单位：
Himeji Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1992
资助国家：
日本
起止时间：
1992 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-04266218/
关键词：
アラニン能動輸送 Na^+大量発現融合タンパン質

项目摘要

好熱菌PS3のアラニン能動輸送体(ACP)は分子量約42,500Daの単一ポリペプチドからなり、H^+あるいはNa^+の電気化学的ポテンシャルによって駆動されるH^+(Na^+)/基質(アラニン、グリシン、セリン)シンポーターである。昨年までに我々はこの精製タンパク質から得たペプチド断片のアミノ酸配列の情報をもとにACPをコードする遺伝子のクローニングに成功した。本研究ではこのACP遺伝子のOREの全構造を決定し、さらに、太陽菌内での発現系の確立を目標とした。本年度の具体的成果は次の通りである。1.これまでにACPのN末端に関する情報が得られていなかったのでinversePCRにより5'上流を決定したところ、156〜154の位置に終止コドン(TAA)が見いだされACP遺伝子のOREは1335塩基よりなることが判明した。2.ACPのKyte-Doolittle法によるハイドロパシー解析から10〜12個の疎水性領域がみられ、さらに最低8本の膜貫通セグメントの存在が予測され、また、ホモロジー解析から南極の海洋細菌Alteromonas haloplanktisのNa^+依存性D-アラニン輸送体遺伝子(dagA)と高いホモロジーがみられた。3.ACPの構造/機能連関を探るために大量発現系の確立は必須な過程である。まず、ACP遺伝子をT7プロモータに直接つなげる方法で大腸菌内での発現を試みたが不成功に終わった。そこでマルトース結合タンパク質遺伝子(MalE)との融合遺伝子を作製し大腸菌内で発現させたところ、IPTG添加によって全膜タンパク質の約15%に及ぶ量の分子量約85kDaのタンパク質が細胞膜画分に誘導発現された。これはマルトース結合タンパク質(分子量約43kDa)とACPの融合タンパク質と考えられる。現在この融合タンパク質から活性のあるACPの回収を試みている。

The active transporter (ACP) of PS3 has a molecular weight of about 42,500 Da and a molecular weight of about 42,500 Da. It has a molecular weight of about 42,500 Da. It has a molecular weight of about 42,500 Da. It has a molecular weight of about 42,500 Da. It has a molecular weight of about 42,500 Da. Last year, we successfully refined the information on the distribution of ACP fragments. The purpose of this study is to determine the overall structure of the ORE of the ACP gene, and to establish the development system of the ORE in the sun. This year's concrete achievements are the second in line. 1. The information on the N-terminal of ACP was obtained from the inversePCR from 5'upstream to determine the terminal (TAA) from 156 to 154. 2. The Kyte-Doolittle method for ACP analysis of the presence of 10 - 12 aqueous domains, the lowest 8 membrane penetrations, and the Na^+-dependent D-transporter (dagA) of Antarctic marine bacteria Alteromonas haloplankton. 3. The structural/functional relationship of ACP is explored, and a large number of development systems are established. The method of direct detection of the ACP gene in Escherichia coli was unsuccessful. The fusion protein of MalE and MalE was induced in E. coli by adding IPTG to the whole membrane of MalE and a small amount of MalE with a molecular weight of 85kDa. The fusion protein (molecular weight about 43kDa) and ACP were identified by the following methods: Now, the fusion of the two substances, the ACP, the recovery of the two substances,