好熱菌PS3のH^+(Na^+)/アラニンシンポーターの分子機構

好熱菌PS3のアラニン能動輸送体(ACP)は分子量約42,500Daの単一ポリペプチドからなり、H^+あるいはNa^+の電気化学的ポテンシャルによって駆動されるH^+(Na^+)/基質(アラニン、グリシン、セリン)シンポーターである。昨年までに我々はこの精製タンパク質から得たペプチド断片のアミノ酸配列の情報をもとにACPをコードする遺伝子のクローニングに成功した。本研究ではこのACP遺伝子のOREの全構造を決定し、さらに、太陽菌内での発現系の確立を目標とした。本年度の具体的成果は次の通りである。1.これまでにACPのN末端に関する情報が得られていなかったのでinversePCRにより5'上流を決定したところ、156〜154の位置に終止コドン(TAA)が見いだされACP遺伝子のOREは1335塩基よりなることが判明した。2.ACPのKyte-Doolittle法によるハイドロパシー解析から10〜12個の疎水性領域がみられ、さらに最低8本の膜貫通セグメントの存在が予測され、また、ホモロジー解析から南極の海洋細菌Alteromonas haloplanktisのNa^+依存性D-アラニン輸送体遺伝子(dagA)と高いホモロジーがみられた。3.ACPの構造/機能連関を探るために大量発現系の確立は必須な過程である。まず、ACP遺伝子をT7プロモータに直接つなげる方法で大腸菌内での発現を試みたが不成功に終わった。そこでマルトース結合タンパク質遺伝子(MalE)との融合遺伝子を作製し大腸菌内で発現させたところ、IPTG添加によって全膜タンパク質の約15%に及ぶ量の分子量約85kDaのタンパク質が細胞膜画分に誘導発現された。これはマルトース結合タンパク質(分子量約43kDa)とACPの融合タンパク質と考えられる。現在この融合タンパク質から活性のあるACPの回収を試みている。

好熱菌PS3のアラニン能動輸送体(ACP)は分子量約42,500Daの単一ポリペプチドからなり、H^+あるいはNa^+の電気化学的ポテンシャルによって駆動されるH^+(Na^+)/基質(アラニン、グリシン、セリン)シンポーターである。昨年までに我々はこの精製タンパク質から得たペプチド断片のアミノ酸配列の情報をもとにACPをコードする遺伝子のクローニングに成功した。本研究ではこのACP遺伝子のOREの全構造を決定し、さらに、太陽菌内での発現系の確立を目標とした。本年度の具体的成果は次の通りである。1.これまでにACPのN末端に関する情報が得られていなかったのでinversePCRにより5'上流を決定したところ、156〜154の位置に終止コドン(TAA)が見いだされACP遺伝子のOREは1335塩基よりなることが判明した。2.ACPのKyte-Doolittle法によるハイドロパシー解析から10〜12個の疎水性領域がみられ、さらに最低8本の膜貫通セグメントの存在が予測され、また、ホモロジー解析から南極の海洋細菌Alteromonas haloplanktisのNa^+依存性D-アラニン輸送体遺伝子(dagA)と高いホモロジーがみられた。3.ACPの構造/機能連関を探るために大量発現系の確立は必須な過程である。まず、ACP遺伝子をT7プロモータに直接つなげる方法で大腸菌内での発現を試みたが不成功に終わった。そこでマルトース結合タンパク質遺伝子(MalE)との融合遺伝子を作製し大腸菌内で発現させたところ、IPTG添加によって全膜タンパク質の約15%に及ぶ量の分子量約85kDaのタンパク質が細胞膜画分に誘導発現された。これはマルトース結合タンパク質(分子量約43kDa)とACPの融合タンパク質と考えられる。現在この融合タンパク質から活性のあるACPの回収を試みている。