Na^+/H^+駆動型アミノ酸トランスポーターの構造・機能協関

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好熱菌PS3のアラニン能動輸送体(ACP)は分子量約42.5kDaの単一ポリペプチドからなり、Na^+あるいはH^+の電気化学的ポテンシャルによって駆動されるNa^+/H^+駆動型アミノ酸(アラニン、グリシン、セリン)トランスポーターである。昨年度までに、acp遺伝子を大腸菌内で発現させることによりN末端領域についての知見が得られ、さらに、マルトース結合タンパク質(MBP)との融合タンパク質の形で大量に発現させることが可能となった。本年度はさらに(1)結晶化を目標とし生理機能を有するACP精製タンパク質の大量発現系の構築、(2) ACP相同タンパク質をコードする遺伝子のクローニング及び輸送機能の解析などについて試みた。(1)については、昨年度までに、大腸菌のマルトース結合タンパク質(MBP)発現ベクター(pMALc2)にacp遺伝子を挿入し融合タンパク質MBP-ACPとして大量発現させるようなプラスミド(pAC6268)を構築し、大腸菌TB1株で発現させる系を確立したが、この大量発現した融合タンパク質の輸送比活性は本来のACPの1%以下と低かった。そこで大量発現によって生じた不溶性タンパク質のrenaturationに用いられている大腸菌シャペロニンGroEL/ES複合体遺伝子との共発現を試み、MBP-ACPを共発現するクローンが得られた。また、(2)については、大腸菌ゲノム計画により見いだされた配列の中にACPと相同性の高いORF476が存在していることが明らかとなっているので、このORF476がアラニン輸送体としての機能をもっているかを調べるために、この遺伝子のクローニングを行い輸送機能の解析を行った。ORF476についてはすでに塩基配列が決定されているので、遺伝研小原先生よりご分与頂いたファージライブラリーからPCRを用いてクローニングし、pBR322に組み込んだプラスミドpFE476を作製し、大腸菌アラニン・グリシン輸送欠損株RM1に導入したところ輸送能の回復が見られ、ORF476もACPやA. DagAのホモログであることが明らかとなった。