Na^+/H^+駆動型アミノ酸トランスポーターの構造・機能協関

Na^+/H^+驱动的氨基酸转运蛋白的结构和功能关系

• 批准号: 08268243
• 负责人: 平田 肇
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Himeji Institute of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08268243/
• 关键词: アミノ酸トランスポーター; 融合タンパク質; 大量発現; 好熱菌; GroEL; ES; 大腸菌

好熱菌PS3のアラニン能動輸送体(ACP)は分子量約42.5kDaの単一ポリペプチドからなり、Na^+あるいはH^+の電気化学的ポテンシャルによって駆動されるNa^+/H^+駆動型アミノ酸(アラニン、グリシン、セリン)トランスポーターである。昨年度までに、acp遺伝子を大腸菌内で発現させることによりN末端領域についての知見が得られ、さらに、マルトース結合タンパク質(MBP)との融合タンパク質の形で大量に発現させることが可能となった。本年度はさらに(1)結晶化を目標とし生理機能を有するACP精製タンパク質の大量発現系の構築、(2) ACP相同タンパク質をコードする遺伝子のクローニング及び輸送機能の解析などについて試みた。(1)については、昨年度までに、大腸菌のマルトース結合タンパク質(MBP)発現ベクター(pMALc2)にacp遺伝子を挿入し融合タンパク質MBP-ACPとして大量発現させるようなプラスミド(pAC6268)を構築し、大腸菌TB1株で発現させる系を確立したが、この大量発現した融合タンパク質の輸送比活性は本来のACPの1%以下と低かった。そこで大量発現によって生じた不溶性タンパク質のrenaturationに用いられている大腸菌シャペロニンGroEL/ES複合体遺伝子との共発現を試み、MBP-ACPを共発現するクローンが得られた。また、(2)については、大腸菌ゲノム計画により見いだされた配列の中にACPと相同性の高いORF476が存在していることが明らかとなっているので、このORF476がアラニン輸送体としての機能をもっているかを調べるために、この遺伝子のクローニングを行い輸送機能の解析を行った。ORF476についてはすでに塩基配列が決定されているので、遺伝研小原先生よりご分与頂いたファージライブラリーからPCRを用いてクローニングし、pBR322に組み込んだプラスミドpFE476を作製し、大腸菌アラニン・グリシン輸送欠損株RM1に導入したところ輸送能の回復が見られ、ORF476もACPやA. DagAのホモログであることが明らかとなった。

So hot in the fungus PS3 の ア ラ ニ ン active transport body (ACP) は molecular weight is about 42.5 kDa の 単 a ポ リ ペ プ チ ド か ら な り, Na ^ + あ る い は H ^ + の electric 気 chemical ポ テ ン シ ャ ル に よ っ て 駆 dynamic さ れ る Na + / H ^ ^ + 駆 moving type ア ミ ノ acid (ア ラ ニ ン, グ リ シ ン, セ リ ン) ト ラ ン ス ポ ー タ ー で あ る . Yesterday's annual ま で に, acp but 伝 を coliform in で 発 now さ せ る こ と に よ り N terminal areas に つ い て の knowledge が must ら れ, さ ら に, マ ル ト ー ス combining タ ン パ ク mass (MBP) と の fusion タ ン パ ク の forms で large に 発 now さ せ る こ と が may と な っ た. This year は さ ら に (1) crystallization を target と し physiology を have す る ACP refined タ ン パ ク qualitative の 発 now is の construct, (2) the ACP same タ ン パ ク qualitative を コ ー ド す る posthumous son 伝 の ク ロ ー ニ ン グ and analytical な び conveying function の ど に つ い て try み た. (1) に つ い て は, yesterday's annual ま で に, coliform の マ ル ト ー ス combining タ ン パ ク mass (MBP) 発 now ベ ク タ ー (pMALc2) に acp heritage 伝 son を scions into し fusion タ ン パ ク qualitative MBP - acp と し て large 発 now さ せ る よ う な プ ラ ス ミ ド (pAC6268) を build し, coliform TB1 strains で 発 now さ せ The る system を establishes that a large number of <s:1> たが and <s:1> are present, <s:1> た fusion タ, <s:1> パ the <s:1> mass <s:1> transport ratio is lower than that of the original <s:1> ACP <e:1> of less than 1% と った った. そ こ で large 発 now に よ っ て raw じ た insoluble タ ン パ ク qualitative の renaturation に with い ら れ て い る coliform シ ャ ペ ロ ニ ン GroEL/ES complex heritage 伝 son と の 発 を now try み, MBP - ACP を 発 now total す る ク ロ ー ン が must ら れ た. ま た, (2) に つ い て は, coliform ゲ ノ ム project に よ り see い だ さ れ た match column の gay の に ACP と phase in the high い ORF476 が exist し て い る こ と が Ming ら か と な っ て い る の で, こ の ORF476 が ア ラ ニ ン conveying body と し て の function を も っ て い る か を adjustable べ る た め に, こ の heritage 伝 son の ク ロ ー ニ ン The グを line グを conveyor can <s:1> analyze the を line った. ORF476 に つ い て は す で に salt base with column が decided さ れ て い る の で, but Mr 伝 grind small original よ り ご points with top い た フ ァ ー ジ ラ イ ブ ラ リ ー か ら PCR を with い て ク ロ ー ニ ン グ し, pBR322 に group み 込 ん だ プ ラ ス ミ ド pFE476 を as し, coliform ア ラ ニ ン · グ リ シ ン conveying owe damage strain RM1 に Import し た と こ ろ conveyor can reply が の see ら れ, ORF476 も ACP や a. DagA の ホ モ ロ グ で あ る こ と が Ming ら か と な っ た.

项目成果

平田 肇: "“生物物理から見た生命像2 生体膜-生命の基本形を形づくるもの"葛西道生、田口隆久編" 吉岡書店, 19 (1996)

Hajime Hirata：“从生物物理学的角度看生命的形象2：生物膜——什么形成了生命的基本形式”，葛西道夫和田口贵久编辑，吉冈书店，19（1996）

Kamata, H.: "Involvement of cellular redox state in cell survival and neuronal differentiation in PC12 cells." Biochem. Soc. Trans.24. 541- (1996)

Kamata, H.：“细胞氧化还原状态参与 PC12 细胞的细胞存活和神经元分化。”

Kamata,H.: "Suppression of NGF-induced Neuronal Differentiation of PC12 Cells ; N Acetylcysteine (NAC) uncouples the Signal Transduction from Ras to the MAP Kinase Cascade." J.Biol.Chem.271. 33018-33025 (1996)

Kamata, H.：“抑制 NGF 诱导的 PC12 细胞神经元分化；N 乙酰半胱氨酸 (NAC) 解偶联从 Ras 到 MAP 激酶级联的信号转导。”

Asakura, S.: "Fibroblasts spread on immobilized fibrin monomer by mobilizing a β1-class integrin, together with a vitronectin receptor αvβ3 on their surface." J. Biol. Chem.272 (in press). (1997)

Asakura, S.：“成纤维细胞通过动员 β1 类整合素及其表面的玻连蛋白受体 αvβ3 来扩散。J. Biol。272（出版中）。”

Kamata, H.: "Nerve Growth Factor and Forskolin prevent H2O2-induced Apoptosis in PC12 Cells by Glutathione Independent Mechanism." Neurosci. Lett.212. 179-182 (1996)

Kamata, H.：“神经生长因子和毛喉素通过谷胱甘肽独立机制防止 H2O2 诱导的 PC12 细胞凋亡。”