Na^+/H^+駆動型アミノ酸トランスポーターの構造・機能協関

Na^+/H^+驱动的氨基酸转运蛋白的结构和功能关系

• 批准号: 08268243
• 负责人: 平田 肇
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Himeji Institute of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08268243/
• 关键词: アミノ酸トランスポーター; 融合タンパク質; 大量発現; 好熱菌; GroEL; ES; 大腸菌

好熱菌PS3のアラニン能動輸送体(ACP)は分子量約42.5kDaの単一ポリペプチドからなり、Na^+あるいはH^+の電気化学的ポテンシャルによって駆動されるNa^+/H^+駆動型アミノ酸(アラニン、グリシン、セリン)トランスポーターである。昨年度までに、acp遺伝子を大腸菌内で発現させることによりN末端領域についての知見が得られ、さらに、マルトース結合タンパク質(MBP)との融合タンパク質の形で大量に発現させることが可能となった。本年度はさらに(1)結晶化を目標とし生理機能を有するACP精製タンパク質の大量発現系の構築、(2) ACP相同タンパク質をコードする遺伝子のクローニング及び輸送機能の解析などについて試みた。(1)については、昨年度までに、大腸菌のマルトース結合タンパク質(MBP)発現ベクター(pMALc2)にacp遺伝子を挿入し融合タンパク質MBP-ACPとして大量発現させるようなプラスミド(pAC6268)を構築し、大腸菌TB1株で発現させる系を確立したが、この大量発現した融合タンパク質の輸送比活性は本来のACPの1%以下と低かった。そこで大量発現によって生じた不溶性タンパク質のrenaturationに用いられている大腸菌シャペロニンGroEL/ES複合体遺伝子との共発現を試み、MBP-ACPを共発現するクローンが得られた。また、(2)については、大腸菌ゲノム計画により見いだされた配列の中にACPと相同性の高いORF476が存在していることが明らかとなっているので、このORF476がアラニン輸送体としての機能をもっているかを調べるために、この遺伝子のクローニングを行い輸送機能の解析を行った。ORF476についてはすでに塩基配列が決定されているので、遺伝研小原先生よりご分与頂いたファージライブラリーからPCRを用いてクローニングし、pBR322に組み込んだプラスミドpFE476を作製し、大腸菌アラニン・グリシン輸送欠損株RM1に導入したところ輸送能の回復が見られ、ORF476もACPやA. DagAのホモログであることが明らかとなった。

The thermal active transporter (ACP) of PS3 has a molecular weight of about 42.5 kDa and a molecular weight of about 42.5 kDa. It has a molecular weight of about 42.5 kDa and a molecular weight of about 42.5 kDa. In the past year, acp gene was found in E. coli, and it was possible that the N-terminal domain was found in large quantities in combination with MBP. This year, we will focus on (1) the construction of a mass production system for ACP purification and quality control for crystallization purposes and physiological functions, and (2) the analysis of ACP purification and quality control components and transport functions. (1)In the past year, Escherichia coli strains have been established in combination with MBP-ACP (pMALc2), acp gene has been incorporated into the fusion protein, MBP-ACP (pAC6268) has been found in large quantities, and the transport ratio of ACP to MBP-ACP is less than 1% of the original activity. A large number of insoluble compounds were found in E. coli during regeneration, and co-occurrence of MBP-ACP was found in E. coli during regeneration. The ORF476 exists in the middle of the alignment of the ACP and the identity of the ORF 476. The ORF476 has the function of a transporter. ORF476 contains the sequence of DNA fragments that determine the sequence of DNA fragments. ORF476 contains the sequence of DNA fragments and DNA fragments. ORF476 contains the sequence of DNA fragments and DNA fragments. ORF476 contains the sequence of DNA fragments and DNA fragments. ORF476 contains the sequence of DNA fragments. DagA

项目成果

平田 肇: "“生物物理から見た生命像2 生体膜-生命の基本形を形づくるもの"葛西道生、田口隆久編" 吉岡書店, 19 (1996)

Hajime Hirata：“从生物物理学的角度看生命的形象2：生物膜——什么形成了生命的基本形式”，葛西道夫和田口贵久编辑，吉冈书店，19（1996）

Kamata, H.: "Involvement of cellular redox state in cell survival and neuronal differentiation in PC12 cells." Biochem. Soc. Trans.24. 541- (1996)

Kamata, H.：“细胞氧化还原状态参与 PC12 细胞的细胞存活和神经元分化。”

Kamata,H.: "Suppression of NGF-induced Neuronal Differentiation of PC12 Cells ; N Acetylcysteine (NAC) uncouples the Signal Transduction from Ras to the MAP Kinase Cascade." J.Biol.Chem.271. 33018-33025 (1996)

Kamata, H.：“抑制 NGF 诱导的 PC12 细胞神经元分化；N 乙酰半胱氨酸 (NAC) 解偶联从 Ras 到 MAP 激酶级联的信号转导。”

Asakura, S.: "Fibroblasts spread on immobilized fibrin monomer by mobilizing a β1-class integrin, together with a vitronectin receptor αvβ3 on their surface." J. Biol. Chem.272 (in press). (1997)

Asakura, S.：“成纤维细胞通过动员 β1 类整合素及其表面的玻连蛋白受体 αvβ3 来扩散。J. Biol。272（出版中）。”

Kamata, H.: "Nerve Growth Factor and Forskolin prevent H2O2-induced Apoptosis in PC12 Cells by Glutathione Independent Mechanism." Neurosci. Lett.212. 179-182 (1996)

Kamata, H.：“神经生长因子和毛喉素通过谷胱甘肽独立机制防止 H2O2 诱导的 PC12 细胞凋亡。”