大腸菌tRNA遺伝子の重複機構

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大腸菌のイソロイシン(AUA)tRNA遺伝子はゲノム上に一個しか存在しないが,このtRNA遺伝子をアンバーサプレッサーに換えてラムダファージにクローン化した。このファージ粒子の密度は野生型ラムダファージのそれに近く,サプレッサー活性は弱いのでX-Galプレートで薄いブループラークを作る。このファージの増殖中にtRNA遺伝子の重複が生じたとすると,ファージ粒子密度がわずかに増加すると共に,サプレッサー活性は倍になりXGalプレートで濃いブループラークを作ることが期待できる。実際にtRNA遺伝子1個分の重複が検出できることを示す対照実験として,グルタミンtRNA遺伝子のsingletとdoubletの二種類のファージを混合し(10^9:10^4)Cscl密度勾配遠心にかけ,わずかに重いフラクションの再遠心をくり返してtRNA遺伝子1個分の重複(doublet)の検出を試みた。この場合,doublet tRNA遺伝子にはオーカーマーカーをつけ,ファージにもプラークタイプや宿主域マーカーをつけて,singletをもつものと区別できるように工夫しておいた。最適の遠心条件を調べたのち,4回の遠心をくり返すことで,対照のdoublet tRNA遺伝子をもつファージをプラークの色の違いで見い出すことに成功した。イソロイシン(AUA)tRNA遺伝子をもつファージ10^9粒子を同時に遠心し,サプレッサー活性が強いと判定したプラーク12個を分離した。次にこれらのファージがもつtRNA遺伝子がdoubletであるかどうかをPCR法によって調べた。その結果,12個ともdoublet遺伝子に対応するようなDNAフラグメントの増幅は見られなかった。よって通常のファージ調製液にはdoublet tRNA遺伝子をもつものは10^<-5>より低い頻度しか存在しなく,tRNA遺伝子が特に重複を起こしやすいことは見い出せなかった。