超高感度HPLC/レーザー蛍光法による中枢シナプスの逆行性情報伝達物質の検索

使用超高灵敏度 HPLC/激光荧光法寻找中央突触中的逆行信息传递器

• 批准号: 05260205
• 负责人: 澤田 嗣郎
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-05260205/
• 关键词: 情報伝達物質; アラキドン酸; プロスタグランジン類; 高感度同時分析; 前処理法; 血液; レーザー蛍光法; 液体クロマトグラフ

シナプスにおける情報伝達物質としてアラキドン酸とその代謝物が想定されている。そこで、シナプスのような微小で、しかも微量にしか得られないサンプルで超微量のアラキドン酸とその代謝物を分析する必要がある。しかし、夾雑物の多い実際の生体試料中でfmol(10^<-15>mol)領域の超微量物質を分析することは、これまで事実上不可能であった。そこで、本研究では、HPLC/LIFによりこれらの物質群を高感度にしかも多種類同時に分析し、前述の神経伝達物質の存在と放出を分析化学的に確かめることを研究の目的とする。昨年度までに、エキシマレーザーを励起光源、ADAM試薬(9-Anthryldiazomethane)を蛍光誘導体化試薬とするHPLC/LIF分析法を開発し、標準試料ではサブ-fmolレベルのプロスタグランジン類の高感度同時分析を実現した。本年度は、微小且つ微量しか得られない生体試料中でこれらの物質群の検索に適応できる前処理法を開発した。具体的な成果は以下の通りである。【1】実際の微量生体試料に本法を適用するために、分析手順を全面的に見直した。特に、ADAM試薬の不安定性が超微小量の分析に多大な影響を及ぼすため、試薬精製、反応条件等を、高感度なLIFに適用可能な条件に改善した。具体的には、ADAMの極性とジアゾ基の反応性を考慮して、水-エタノール-ペンタン三相系溶媒抽出法の開発、エタノール中での誘導体化(エステル化)、微量(2%)エタノール添加のペンタン-クロロホルム混合溶媒による夾雑物質除去等を開発した。以上の結果、プラスマに50pgのプロスタグランジンF1αを添加した試料で良好なクロマトグラムを得ることができた。プラスマ中の検出限界は10pg/mlであった。【2】開発した分析手順を臨床試料に応用した。プロスタグランジンE1誘導体を投与後、血中のプロスタグランジンE1濃度を本法によりモニターした。1ng/ml前後の変化を明瞭に追跡でき、本法が実際の生体試料中の超微量分析にも適用できることを確認した。実際の生体試料、特に夾雑物の多い血液でサブ-ng/mlレベルの分析を実証した例は本例が最初と考える。

The information of the substance and the metabolites of the compound are determined. It is necessary to analyze trace amounts of acid and metabolites. It is impossible to analyze trace substances in the field of fmol(10^<-15>mol) in many biological samples. The purpose of this study is to determine the existence and release of these substances by HPLC/LIF with high sensitivity and simultaneous analysis of multiple species. The HPLC/LIF analytical method was developed by using excitation light source, ADAM reagent (9-Anthryldiazomethane) and high sensitivity simultaneous analysis of standard samples. This year, a pretreatment method for the detection of these substances in biological samples was developed in small and trace amounts. Specific achievements are as follows. [1] This method is applicable to all trace biological samples. In particular, the instability of ADAM test reagents can be reduced to account for the large impact on ultra-small amount analysis, test reagent refinement, reaction conditions, etc., and high-sensitivity LIF applicability conditions can be improved. Specifically, ADAM polarity and reactivity were taken into account, water-based three-phase solvent extraction method was developed, induction in the solvent system was developed, and trace (2%) addition of impurities in mixed solvents was developed. The above results show that the sample size of 50pg can be added to the sample size.プラスマ中の検出限界は10pg/mlであった。[2] Development of analytical procedures for clinical trials After the administration of the E1 inducer, the concentration of E1 in the blood was determined. 1ng/ml before and after the change in the trace, the method is practical in the analysis of biological samples in the ultra-small amount of the application of this method is confirmed The analysis of biological samples, special substances and many kinds of blood samples was carried out in this case.

项目成果

R.Tsutsumiuchi,et al.: "Monitoring of Prostaglangin Concentration in Human Blood by HPLC/LIF" Prostaglangins. (発表予定). (1994)

R.Tsutsumiuchi 等人：“通过 HPLC/LIF 监测人体血液中的前列腺素浓度”（待提交）。

S.Sakae,et al.: "Ultrasensitive Simultaneous Determination of Prostaglangins in Biological Samples by HPLC/LIF" Microchem.Acta.(in press). (1994)

S.Sakae 等人：“通过 HPLC/LIF 超灵敏同时测定生物样品中的前列腺素”Microchem.Acta.（出版中）。

R.Tsutsumiuchi,et al.: "Extraction and Simultaneous Determination of Sub-ng Prostaglangins in Blood by HPLC/LIF" Analytical Chemistry. (発表予定). (1994)

R.Tsutsumiuchi 等人：“通过 HPLC/LIF 提取和同时测定血液中的亚 ng 前列腺素”分析化学（即将发表）。