ヌクレオチド代謝系酵素によるRNA認識機構の解析

本研究はA、G、U、Cそれぞれのヌクレオチドに特異的な大腸菌ヌクレオチド一りん酸キナーゼ(NK)について大量発現系を作成し、NMPの酵素的りん酸化(NTP合成)へ利用することと、NKを核磁気共鳴などの方法により立体構造レベルで解析して互いの共通点・相違点を調べ、NKの核酸塩基識別機構を解明することを目的としている。本年度はGMPキナーゼ遺伝子を既に決定されている塩基配列に基づいてPCR法により発現ベクターにクローニングした。その結果、GMPキナーゼを非常に効率良く発現させることができ、細胞粗抽出液でも高い活性を得ることができた。GMPキナーゼは安定な酵素で精製も容易であるので、この系は本酵素の安定供給に有用であると思われる。GMPキナーゼの構造については、既に一次構造、立体構造が決定されているパン酵母のGMPキナーゼとの一次構造上のホモロジーおよび二次構造予測を参考にして立体構造のモデリングを行なった。その結果、ふたつの酵素は一次構造上3ヶ所のギャップが存在するものの、立体構造上ほとんど同一であることが予想された。さらに、このモデルを既に決定されている大腸菌AMPキナーゼの立体構造と比較してみたところ、ATPの結合に関与する領域の構造は良く保存されているが、GMPまたはAMPの結合する領域の構造は大きく異なっていることが明らかとなった。

本研究はA、G、U、Cそれぞれのヌクレオチドに特異的な大腸菌ヌクレオチド一りん酸キナーゼ(NK)について大量発現系を作成し、NMPの酵素的りん酸化(NTP合成)へ利用することと、NKを核磁気共鳴などの方法により立体構造レベルで解析して互いの共通点・相違点を調べ、NKの核酸塩基識別機構を解明することを目的としている。本年度はGMPキナーゼ遺伝子を既に決定されている塩基配列に基づいてPCR法により発現ベクターにクローニングした。その結果、GMPキナーゼを非常に効率良く発現させることができ、細胞粗抽出液でも高い活性を得ることができた。GMPキナーゼは安定な酵素で精製も容易であるので、この系は本酵素の安定供給に有用であると思われる。GMPキナーゼの構造については、既に一次構造、立体構造が決定されているパン酵母のGMPキナーゼとの一次構造上のホモロジーおよび二次構造予測を参考にして立体構造のモデリングを行なった。その結果、ふたつの酵素は一次構造上3ヶ所のギャップが存在するものの、立体構造上ほとんど同一であることが予想された。さらに、このモデルを既に決定されている大腸菌AMPキナーゼの立体構造と比較してみたところ、ATPの結合に関与する領域の構造は良く保存されているが、GMPまたはAMPの結合する領域の構造は大きく異なっていることが明らかとなった。