蛋白質結晶内反応を可視吸収変化により追跡するシステムの性能評価

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平成5年度の本重点領域研究の研究費により、我々は結晶マウント用ステージ及び光学部品を購入し、実験室レベルで簡便に結晶の可視吸収スペクトルを測定できるシステムを構築した。しかしこのシステムは単純な球面レンズの組み合わせで構成したため、色収差が大きく、またモニター光を結晶に性格にアライメントすることが難しいという欠点を持っていた。そこで平成6年度は落射蛍光顕微鏡を蛋白結晶の可視吸収スペクトル測定装置として利用することを目的とし以下のような改造を行なった。1.色収差の小さい顕微鏡の光学系を用いることにより色収差を少なくした。2.1辺の長さ50〜500ミクロン程度の結晶を顕微鏡下で目視しながら位置合わせをすることにより光軸のアライメントを比較的容易に行うことが可能となった。3.観測光源から発して結晶を透過した光を、顕微鏡のサイドポートから取り出して光ファイバーを通して分光器に導入するように改造した。以上のシステムを用いることにより50ミクロン以上の結晶のスペクトル測定が可能であることを確認した(足立、飯塚、城)。さらに平成6年度は結晶の可視吸収スペクトル測定装置開発を進めるうえで非常に重要な結晶試料の探索も平行して行ない、ヘムを含んだ酵素であるチトクロムP450norの結晶の反応モニターの可能性についても検討した。チロクロムP450norはNADHを還元剤として用いてNOをN_2Oに還元する反応を触媒するが、この触媒サイクルの中でヘム鉄にNOが結合する過程、およびNADHと混合後にNOが還元されてゆく過程において可視部での大きなスペクトル変化が予測される。今年度は本酵素の結晶化条件の検討を行った(祥雲)。さらに本酵素の結晶内反応の条件等を検討する予定である。