权益分类	功能权益	普通用户	{{item.name}}会员
{{category.name}}	{{benefitItem.name}}

Antisense Display-新しい機能性遺伝子スクリーニング法開発の試み

反义展示——尝试开发新的功能基因筛选方法

基本信息

批准号：
09272210
负责人：
山本博
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Kanazawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究の目的は、ゲノム機能解析のための一手段として、“Antisense Display"法という新しい遺伝子スクリーニング技術を確立することである。本法は、(1)ほぼ総てのmRNA分子種をカバーする-アンチセンスDNAレパートリーの作製-(2)細胞の機能/表現形質変化を来すアンチセンス配列の同定→(3)5′センスプライマーと3′アンカー型プライマーを用いたRT-PCRによるcDNAクローニング→(4)構造決定(5)当該遺伝子の機能検定の計5ステップからなる。平成9年度は、(3)と(4)のステップの検証のため、新規血管新生制御因子の分離に本法を適用した。1.内皮細胞の増殖を指標としてアンチセンスDNAレパートリースクリーニングを行い、最終的に内皮細胞増殖を抑制する単一のアンチセンス配列を同定した。2.同定されたアンチセンス配列に対応するセンスプライマーとアンカー型オリゴ(dT)プライマーを用いヒト微小血管内皮細胞ポリA^+RNAを鋳型にてRT-PCR法を行い候補cDNAを3種分離した。3.得られたcDNAの塩基配列を決定した結果、cDNAの一つ(clone2)は10merアンチセンス配列と100%マッチする配列を有し、残りの二種(clone30,32)はアンチセンス配列と10塩基中9塩基が一致する配列を有していた。4.DNA配列データベースでの相同性検索の結果、clone2はミトコンドリアNADH-ubiquinone oxidoreductase chain 3をコードするcDNAであることが判明した。また、clone30,32は新規遺伝子で、それぞれ酵母のMIC1 cDNA、マウスのNck interacting kinase(NIK)cDNAと相同性を示した。次に、10mer領域を含む各mRNAに特異的な16〜18塩基のアンチセンスオリゴヌクレオクドを作製し、各アンチセンスがヒト微小血管内皮細胞DNA合成に及ぼす影響を解析した結果、clone2とclone30に相補的なアンチセンスがDNA合成を阻害した。コントロールのセンスオリゴヌクレオチドおよびclone32に対するアンチセンスは内皮細胞DNA合成に影響を及ぼさなかった。以上より、ミトコンドリアNADH-ubiquinone oxidoreductase chain3遺伝子と酵母MIC1と相同性を示す新規遺伝子clone30が内皮細胞増殖に関与することが示された。MIC1蛋白は酵母転写因子Maclpに結合する蛋白質で、関連遺伝子が脊椎動物で分離されたのは初めてである。5.本法の有効性を他のモデルで検証するため、新規がん抑制遺伝子の分離を目的にNIH3T3細胞の足場非依存性増殖を指標にアンチセンスDNAレパートリーの一次スクリーニングを行った。その結果、足場非依存性増殖を促進する数種の候補サブプールを得た。以上、本年度研究により機能性遺伝子スクリーニング法として“Antisense Display"法が有効であることが示された。

The purpose of this study is to establish a new method for functional analysis of Antisense Display. The method comprises the following steps: (1) determining the mRNA molecular species of the gene;(2) identifying the gene sequence of the gene sequence of the gene sequence In 2009, the method was applied to the separation of angiogenesis control factors. 1. Endothelial cell proliferation index and DNA sequence were determined simultaneously, and finally endothelial cell proliferation inhibition index and DNA sequence were determined. 2. Three candidate cDNAs were isolated from microvascular endothelial cells by RT-PCR. 3. The results showed that the cDNA sequence was consistent with that of the 10mer sequence (clone2) and 100% sequence (clone30,32) residues. 4. The results of identity analysis of DNA sequence showed that clone2 was the first to be cloned into NADH-ubiquinone oxidase chain 3, and the second to be cloned into cDNA. Nck interacting kinase(NIK)cDNA and MIC1 cDNA of yeast were identified. The second and 10mer regions contain 16 - 18 base pairs specific to each mRNA, and each base pair has a complementary effect on DNA synthesis and inhibition of DNA synthesis in microvascular endothelial cells. The DNA synthesis of endodermal cells is affected by the presence of a host cell and a host cell. The above results show that the NADH-ubiquinone oxidase chain3 gene is related to endothelial cell proliferation. MIC1 protein binds to yeast transcription factor Maclp and is associated with vertebrate isolation. 5. This method is effective for other gene detection, and the new method is effective for inhibiting gene isolation, and the target of NIH 3T3 cell is field independent gene detection. As a result, field-independent propagation is promoted, and several candidate sites are obtained. The above shows that the functional gene fusion method and the "Antisense Display" method used in this year's research are effective.