Antisense Display-新しい機能性遺伝子スクリーニング法開発の試み

反义展示——尝试开发新的功能基因筛选方法

• 批准号: 08283208
• 负责人: 山本 博
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Kanazawa University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08283208/
• 关键词: アンチセンス; Antisense Display; mRNA; 遺伝子機能; 血管新生

本研究は、新しい遺伝子機能解析手段としての"Antisense Display"法の創出を目的とする。本法は、(1)mRNAの5'領域に対し全mRNA分子種をカバーするアンチセンスDNAレパトリ-の作製→(2)所定の細胞形質変化を来すアンチセンス分子種のスクリーニング→(3)5'センスプライマーと3'アンカー型プライマーを用いた翻訳枠全長のクローニング→(4)構造決定→(5)候補遺伝子の機能検定の5ステップからなる。本年度は、ステップ(1)、(2)の検証を行った。1.Kozakのコンセンサス配列に対応する鎖長6〜12塩基のホスホロチオエ-ト型アンチセンスDNAレパートリー化学合成した。2.当該レパートリーの翻訳阻害活性を無細胞蛋白合成系で検証した。その結果、(1)ウサギ網状赤血球ライゼ-トでの翻訳反応はアンチセンスDNAの鎖長に依存して阻害され、10mer以上のレパトリ-ではほぼ完全な阻害が得られた。この蛋白合成阻害は、(2)RNaseHで増強され、(3)鋳型RNAの熱変形なしに達成された。3.以上の検証に基づき、鎖長10merのアンチセンスレパートリーを計128のサブグループに分けて大量合成し、2段階のHPLCで精製した。4.本法は、アンチセンス効果がgain-of-functionとなる抑制性因子の探索により大きな適応があると考えられたので、まず血管新生抑制遺伝子を候補遺伝子として細胞でのスクリーニングを開始した。すなわち、ヒト微小血管内皮細胞を96穴プレートに播種後、アンチセンスサブグループあるいは対照の10merオリゴd(A)の存在下に培養し、内皮細胞の(1)増殖促進と(2)マトリゲル上での管腔形成促進を指標として全サブグループの一次スクリーニングを完了した。この結果、数種の候補サブグループを得、現在二次スクリーニングを進めている。

This study aims to create a new method for analyzing the function of genetic proteins and "Antisense Display." The method comprises the following steps: (1) preparing the complete mRNA molecular species in the 5'domain of mRNA;(2) preparing the complete mRNA molecular species in the 5' domain of mRNA;(3) preparing the complete mRNA molecular species in the 5 'domain of mRNA;(4) determining the structure; and (5) determining the function of the candidate gene. This year, the number of cases (1) and (2) was increased. 1. Kozak's DNA sequence is chemically synthesized from 6 to 12 bases. 2. When the enzyme is activated, the cell-free protein synthesis system is detected. The results are as follows: (1) The length of DNA depends on the length of reticulocyte, and the length of DNA depends on the length of reticulocyte. The inhibition of protein synthesis,(2) increase of RNase H,(3) change of RNA heat. 3. The above reactions were carried out by mass synthesis and purification by HPLC in 128 steps. 4. This method is used to investigate the effect of gain-of-function and inhibitory factors on angiogenesis. After seeding, microvascular endothelial cells were cultured in the presence of 10mer light (A), and endothelial cells (1) were promoted to grow and (2) were promoted to form lumens. This result, several kinds of candidate list, now the second time list, enter the list

项目成果

山本博: "アンチセンスDNA" 生化学. 68. 155 (1996)

山本浩：“反义 DNA”生物化学 68. 155 (1996)

Sho-ichi Yamagishi: "Advanced glycosylation end products stimulate the growth but inhibit the prostacyclinproducing ability of endothelial cells through interactions with their receptors." FEBS Letters. 384. 103-106 (1996)

Sho-ichi Yamagishi：“高级糖基化终产物刺激生长，但通过与内皮细胞受体的相互作用抑制内皮细胞产生前列环素的能力。”

米倉秀人: "「医学のための基礎分子細胞生物学」43章"血管作動性物質"" 平賀紘一、伊達孝保、山本博、野口民夫編(南山堂)(印刷中), (1997)

Hideto Yonekura：“医学基础分子细胞生物学，第 43 章：血管活性物质”，由 Koichi Hiraga、Koyasu Date、Hiroshi Yamamoto 和 Tamio Noguchi 编辑（Nanzando）（印刷中），（1997 年）

Yasuhiko Hayashi: "Astrocytes can transdifferentiate non-neural endothelial cells into the neural type through endfeet-mediated contacts." Journal of Vascular Research. 33. 33 (1996)

Yasuhiko Hayashi：“星形胶质细胞可以通过末端介导的接触将非神经内皮细胞转分化为神经类型。”

Yasuhiko Yamamoto: "Advanced glycation endproducts-receptor interactions stimulate the growth of human pancreatic cancer cells through the induction of platelet-derived growth factor-B" Biochem. Biophys. Res. Commun.222. 700-705 (1996)

Yasuhiko Yamamoto：“高级糖基化终产物-受体相互作用通过诱导血小板衍生生长因子-B 刺激人类胰腺癌细胞的生长”Biochem。