Antisense Display-新しい機能性遺伝子スクリーニング法開発の試み

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本研究は、新しい遺伝子機能解析手段としての"Antisense Display"法の創出を目的とする。本法は、(1)mRNAの5'領域に対し全mRNA分子種をカバーするアンチセンスDNAレパトリ-の作製→(2)所定の細胞形質変化を来すアンチセンス分子種のスクリーニング→(3)5'センスプライマーと3'アンカー型プライマーを用いた翻訳枠全長のクローニング→(4)構造決定→(5)候補遺伝子の機能検定の5ステップからなる。本年度は、ステップ(1)、(2)の検証を行った。1.Kozakのコンセンサス配列に対応する鎖長6〜12塩基のホスホロチオエ-ト型アンチセンスDNAレパートリー化学合成した。2.当該レパートリーの翻訳阻害活性を無細胞蛋白合成系で検証した。その結果、(1)ウサギ網状赤血球ライゼ-トでの翻訳反応はアンチセンスDNAの鎖長に依存して阻害され、10mer以上のレパトリ-ではほぼ完全な阻害が得られた。この蛋白合成阻害は、(2)RNaseHで増強され、(3)鋳型RNAの熱変形なしに達成された。3.以上の検証に基づき、鎖長10merのアンチセンスレパートリーを計128のサブグループに分けて大量合成し、2段階のHPLCで精製した。4.本法は、アンチセンス効果がgain-of-functionとなる抑制性因子の探索により大きな適応があると考えられたので、まず血管新生抑制遺伝子を候補遺伝子として細胞でのスクリーニングを開始した。すなわち、ヒト微小血管内皮細胞を96穴プレートに播種後、アンチセンスサブグループあるいは対照の10merオリゴd(A)の存在下に培養し、内皮細胞の(1)増殖促進と(2)マトリゲル上での管腔形成促進を指標として全サブグループの一次スクリーニングを完了した。この結果、数種の候補サブグループを得、現在二次スクリーニングを進めている。