分子モータ・アクトミオシンのESRによる動的構造解析とその結晶化

ESR及其结晶对分子运动肌动球蛋白的动态结构分析

• 批准号: 09279223
• 负责人: 荒田 敏昭
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09279223/
• 关键词: アクチンモノマー; 非重合アクチン; ミオシンヘッド; アクトミオシン; X線小角散乱; 結晶解析; 電子スピン共鳴; スピンラベル

我々は筋収縮のエネルギー変換を蛋白質の分子構造に立脚して理解するために、最小単位であるアクチンとミオシン頭部の単量体コンプレックスのX線散乱実験とモーター蛋白用にESR技術改良を行った。Gアクチンをマレイミドベンゼン酸エステル、ジアゾニウムテトラゾルで化学修飾した結果、全く重合しないがミオシンと結合するアクチンモノマーを調製し、ミオシン頭部S1との1:1複合体を形成させることに成功した。さらに可逆的に強く結合したアクチン-S1複合体のみの散乱強度曲線は遊離アクチン、S1の散乱を補正して得られ混合モル比に関係せず一致した。算出した慣性半径は50オングストローム、分子量150kDa、最大分子コード長は180オングストローム、アクチン-S1重心間距離70-80オングストロームとなった。今年度はこれらを指標にしてアクチン、S1の原子座標を用いて散乱強度曲線を最適化するドッキング原子モデルを計算機により探索したところ、S1先端近くにアクチンが結合することが確定した。小さいドメイン間内部運動を考慮することにより完全にフィットできた。ATPの場合は複合体の解離がおこってしまい解析不能であったが、ADPでは解離を最小限に抑えた条件で同様の実験することに成功した。その結果、分子量は殆ど変わらず慣性半径が約3-4オングストロームだけ小さくなった。モデル計算ではS1が長軸のまわりに90度以上回転した。この結果はS1の2つの結合部位のち一方は隣接アクチンだけでなくもう一方の結合部位とともに同じアクチンと相互作用できることを示唆する。現在これらのモデルがユニークかどうかマーカー蛋白(DNaseI,軽鎖)を結合させて実験中である。アクチン・ミオシン複合体モノマーの結晶化も精力的に押し進めているがまだ成功には至っていない。モーター蛋白用高感度SRE測定のためループギャップ共振器を試作中である。

I 々 は reinforcement 収 shrinkage の エ ネ ル ギ ー variations in を protein molecular structure の に footing し て understand す る た め に, minimum 単 で あ る ア ク チ ン と ミ オ シ ン head の 単 quantity body コ ン プ レ ッ ク ス の X-ray scattered be 験 と モ ー タ ー protein with に ESR technique improved line を っ た. G ア ク チ ン を マ レ イ ミ ド ベ ン ゼ ン acid エ ス テ ル, ジ ア ゾ ニ ウ ム テ ト ラ ゾ ル で chemically modified し た result, whole く overlap し な い が ミ オ シ ン と combining す る ア ク チ ン モ ノ マ ー を modulation し, ミ オ シ ン head S1 と の 1:1 complex を form さ せ る こ と に successful し た. Strong さ ら に reversible に く combining し た ア ク チ ン - S1 complex の み の scattered intensity curve は free ア ク チ ン, S1 の scattered を corrected し て must ら れ mixed モ ル than に masato is せ ず consistent し た. Calculate し た radius of inertia は 50 オ ン グ ス ト ロ ー ム, 150 kda molecular weight, molecular コ biggest ー ド long は 180 オ ン グ ス ト ロ ー ム, ア ク チ ン - the distance between the center of gravity, 70-80 S1 オ ン グ ス ト ロ ー ム と な っ た. Our は "こ れ ら を index に し て ア ク チ ン, S1 の atomic coordinates を い て scattered intensity curve を optimization す る ド ッ キ ン グ atomic モ デ ル を computer に よ り explore し た と こ ろ, S1, apex nearly く に ア ク チ ン が combining す る こ と が determine し た. The internal motion between small さ, ドメ and ドメ を consider する, にフィットで, とによ, and complete にフィットで, た, た. ATP の occasions は complex の dissociation が お こ っ て し ま い resolution can't で あ っ た が, ADP で は dissociation を minimum に え suppression で た conditions with others の be 験 す る こ と に successful し た. The そ そ result shows that the molecular weight is almost <s:1> variable わらず and the radius of inertia is が approximately 3-4, and the <s:1> グストロ グストロ ムだけ is ムだけ smaller than さくなった. Youdaoplaceholder0 モデ calculate the で で S1が long axis まわ まわ に に returns above 90 degrees 転 た た. こ の results は S1 の 2 つ の combining site の ち side は 隣 meet ア ク チ ン だ け で な く も う side の combining site と と も に with じ ア ク チ ン と interaction で き る こ と を in stopping す る. Now こ れ ら の モ デ ル が ユ ニ ー ク か ど う か マ ー カ ー protein (DNaseI, 軽 lock) を さ せ て be 験 in で あ る. ア ク チ ン · ミ オ シ ン complex モ ノ マ ー の crystallization も energy に detain し into め て い る が ま だ successful に は to っ て い な い. Youdaoplaceholder0 モ タ タ モ protein determination by high-sensitivity SRE <s:1> ため <s:1> プギャップ プギャップ resonator を trial work である.

项目成果

若林克三: "アクチンフィラメントの伸びと筋収縮"日本物理学会誌. 52. 599-605 (1997)

Katsuzo Wakabayashi：“肌动蛋白丝的拉伸和肌肉收缩”日本物理学会杂志 52. 599-605 (1997)。

T.Arata: "Electron Paramagnetic Resonance Studies on ATPase Intermediates and Orientation of Spin-labelled Mvosin Heads in Force-generating Muscle Fibres" J.Muscle Res.Cell Motil.18. 489 (1997)

T.Arata：“ATPase 中间体的电子顺磁共振研究以及产生力的肌肉纤维中自旋标记的 Mvosin 头的方向”J.Muscle Res.Cell Motil.18。

T.Arata: "Current Methods in Muscle Physiology,Advantages,Problems,and Limitations 9.The Use of Spin Probes." ed H.Sugi,Oxford Univ.Press,UK, 376(223-239) (1998)

T.Arata：“当前肌肉生理学方法、优点、问题和局限性 9. 自旋探针的使用。”

杉本泰伸: "ニューバイオフィックス4生体分子モーターの仕組み2-2X線でとらえた分子モーターの形態変化" 石渡信一編 共立出版, 214(86-103) (1997)

Yasunobu Sugimoto：“生物分子马达的新 Biofix 4 机制 2-2 X 射线捕获的分子马达的形态变化”编辑：Shinichi Ishiwata，Kyoritsu Shuppan，214(86-103) (1997)