モーター蛋白質アクトミオシンの結晶化とX線とESRによる分子構造解析

运动蛋白肌动球蛋白的结晶以及使用 X 射线和 ESR 的分子结构分析

• 批准号: 11156218
• 负责人: 荒田 敏昭
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11156218/
• 关键词: アクチンモノマー; 非重合アクチン; ミオシンヘッド; アクトミオシン; X線小角散乱; 電子スピン共鳴; 結晶解析; スピンラベル

我々は筋収縮のエネルギー変換を蛋白質の分子構造に立脚して理解するために、最小単位であるアクチン単、2量、3量体とミオシン頭部の複合体のX線散乱実験とモーター蛋白用にESR精密角度計測を行った。Gアクチンを化学修飾し、全く重合しないがミオシンと結合するアクチンモノマーを調製し、ミオシン頭部S1との1:1複合体を形成させ、複合体のみの散乱強度曲線を得ることに成功していた。アクチン、S1の原子座標を用いて全散乱強度曲線を最適化するドッキング原子モデルを計算機により探索したところ、我々の電顕写真観察で予想されるように、S1先端近くにアクチンが結合することが確定した。ADP中でも解離を最小限に抑えた条件で同様の実験することに成功し、分子量は変わらず慣性半径が約3-4オングストロームだけ小さくなった。モデル計算ではS1が長軸のまわりに90度以上回転した。この結果はATP加水分解中のアクチン-ミオシンの弱い結合の本体を捉えたものと考えれた。今年度はアクチン2量体、3量体を作成し、さらに高次の構造を解析した。重合しない2量体、3量体ともKI中の化学修飾で得られた。低イオン強度ではモノマーと同様1:1複合体を形成し、2:2、3:3複合体ができた。一方90mMKClでは2:1、3:1複合体ができた。また複合体形成によるATP分解促進やATPによる結合強度の変化も認められなかった。90mMKCIにおける2:1または3:1複合体のX線散乱実験も成功し解析を始めた。アクチン・ミオシン複合体モノマーの結晶化も精力的に押し進めているがまだ成功には至っていない。モーター蛋白用高感度ESR測定のためループギャップ共振器を試作し、コンピューター信号処理システムによりスペクトルを記録し引続き調整中である。最近はミオシンネック軽鎖に結合したスピンラベルのESRスペクトルを頭部2つから由来するスペクトル和として精密fitした。その結果弛緩状態でもミオシン頭部は2方向に緩く配向していると考えられる。

I 々 は reinforcement 収 shrinkage の エ ネ ル ギ ー variations in を protein molecular structure の に footing し て understand す る た め に, minimum 単 で あ る ア ク チ ン 単, 2, 3 quantity body と ミ オ シ ン head の complex の X-ray scattered be 験 と モ ー タ ー protein with に ESR precision Angle measuring line を っ た. G ア ク チ ン を chemically modified し, whole く overlap し な い が ミ オ シ ン と combining す る ア ク チ ン モ ノ マ ー を modulation し, ミ オ シ ン head S1 と の 1:1 complex を form さ せ, complex の み の scattered intensity curve を る こ と に successful し て い た. ア ク チ ン, S1 の atomic coordinates を い て all scattered intensity curve を optimization す る ド ッ キ ン グ atomic モ デ ル を computer に よ り explore し た と こ ろ, I 々 の photo electricity 顕 観 examine で to think さ れ る よ う に, S1, apex nearly く に ア ク チ ン が combining す る こ と が determine し た. In the ADP で も dissociation を minimum に え suppression で た conditions with others の be 験 す る こ と に successful し, molecular weight は - わ ら ず が inertia radius of about 3-4 オ ン グ ス ト ロ ー ム だ け small さ く な っ た. Youdaoplaceholder0 モデ calculate the で で S1が long axis まわ まわ に に returns above 90 degrees 転 た た. The <s:1> results of <s:1> ATP in water addition decomposition are ア, チ, <e:1> - シ, シ, シ. The weak <s:1> is combined with the <s:1> body を to capture えた, <s:1> and と to study えれた. This year, ア ア チ チ を 2 volumes and 3 volumes を are used to form <s:1> and さらに higher-order <s:1> structures を. Analysis of た た. The <s:1> chemical modification で in な な な of volume 2 and volume 3 と と KI gives られた. Low <s:1> <s:1> <s:1> strength で で モノ モノ モノ と と と is similar to the 1:1 complex を to form た, 2:2, 3:3 complexes がで た た. A 90mMKClで で 2:1, 3:1 complex がで た た. The formation of the また complex and the decomposition of によるATP promote the <s:1> variation of the やATPによる binding strength. It is agreed that められな った った. 90mMKCIにおける2:1また また 3:1 complex <s:1> X-ray scattering experiment における successful <s:1> analysis を beginning めた. ア ク チ ン · ミ オ シ ン complex モ ノ マ ー の crystallization も energy に detain し into め て い る が ま だ successful に は to っ て い な い. モ ー タ ー protein の is measured by ESR Gao Gan degrees た め ル ー プ ギ ャ ッ プ resonator を try し, コ ン ピ ュ ー タ ー signal 処 Richard シ ス テ ム に よ り ス ペ ク ト ル を record し lead 続 き adjustment of で あ る. Recent は ミ オ シ ン ネ ッ ク 軽 に combination lock し た ス ピ ン ラ ベ ル の ESR ス ペ ク ト ル を head 2 つ か ら origin す る ス ペ ク ト ル and と し て precision fit し た. Youdaoplaceholder0 そ results: The relaxation state of で そ, the <s:1> シ, the <s:1> シ, the シ, the で, the <s:1>, the に, the く, the に, the く, the ると, the ると, the ると, the ると, the ると, and the ると were examined for えられる.

项目成果

荒田敏昭: "筋肉モーター蛋白質アクチンとミオシンのダイナミックな分子構造と相互作用"生化学. 72巻5号(印刷中). (2000)

Toshiaki Arata：“肌肉运动蛋白肌动蛋白和肌球蛋白的动态分子结构和相互作用”，《生物化学》第 72 卷，第 5 期（出版中）。

Y. Takezawa: "Backward Movement of Cross-bridges by Application of Stretch and by Binding of MgADP to Skeletal Muscle Fibers in the Rigor State as Studied by X-ray Diffraction"Biophysical Journal. 76. 1770-1783 (1999)

Y. Takezawa：“通过 X 射线衍射研究，在严格状态下通过应用拉伸和 MgADP 与骨骼肌纤维的结合来实现横桥的向后运动”生物物理学杂志。