微生物生態系解析のためのDNAプロ-ブを利用した組換え微生物の挙動解析

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本研究は、環境生態系に放出された組換え微生物の挙動を解析する方法の開発を目的として、まず組換え体の特定のDNAを検出可能な濃度にまで試験管内で増幅するポリメラ-ゼ・チェ-ン・リアクション法(以下PCR法)の反応条件に関する研究を行なった。またフラスコスケ-ルの安定した混合微生物生態系(活性汚泥を閉鎖系で長期間培養-以下ミクロコズム)にマ-カ-遺伝子を含む微量の大腸菌を導入し、この大腸菌のミクロコズム内での生残性などについてモニタリングする実験を行なった。PCR法に関して得られた実験結果より、プラスミドDNAを制限酵素で切断したDNAをPCR法で増幅する場合には、制限酵素による切断後のDNAの精製操作の必要がないことが知られた。またプラスミドDNAは大腸菌から粗抽出しただけでもPCRH法によって直接増幅することが可能であることが知られた。したがって、適切な反応条件と適切なプライマ-を用いる限、PCR法によるDNAの増幅は環境から抽出した試料についても適用可能であることが示唆された。ミクロコズムにおけるDNA組換え微生物の挙動を調べるために、ミクロコズムの条件を富栄養型と貧栄養型(富栄養型の1/100の濃度の基質を与えたもの)として生残性を調べた。この結果、ミクロコズムの栄養条件に応じて導入微生物の生残性は変化し、富栄養条件下での生残性が高いことが知られた。また、各ミクロコズムに対して組換え微生物の導入後も基質の供給を続けた場合には、栄養のレベルに応じて導入組換え微生物が長期に亙って安定に生残する様子が見られた。本研究で得られた知見および開発された方法を自然環境中の個々の微生物の生態学的機能を調査する方法の開発の基礎として役立て、微生物の動態を追跡するDNAプロ-ブ法の確立を目指したい。