安定同位体を利用したNMRによるRNAの立体構造解析法の開発

开发使用稳定同位素通过核磁共振分析RNA三维结构的方法

• 批准号: 03242203
• 负责人: 河合 剛太
• 金额: $ 1.66万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1991
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1991 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-03242203/
• 关键词: tRNA; 核磁気共鳴; 安定同位体標識; RNA; 立体構造解析

本研究ではtRNAを主な材料として,RNAの水溶液における立体構造あるいは動的な構造を解析するために,RNAにおける安定同位体標識NMRの手法を開発することを目標としている.本年度は,まず効率的な ^<13>C標識の手法の追求,および ^<15>N標識tRNAについての核磁気共鳴の手法の開発を行なった.1.リボ-スプロトンのシグナルの分離をめざした ^<13>C標識 申請時においては,リボ-スの1′の選択的標識をリボ-スー1ー ^<13>Cを用いて行なうことを計画していた.しかしながら,この方法では標識率が低いことが分かったので,グルコ-スー2ー ^<13>Cを用いる方法を考案し検討した.グルコ-スー2ー ^<13>Cを含む最少培地で大腸菌(A19株)を1L培養し,得られた菌体よりRNAを抽出した.これを酵素によってヌクレオシドにまで分解し,4種のヌクレオシドを単離精製した. ^<13>C核とのスピン結合による分裂パタ-ンから,リボ-スの1′位が80%の効率で標識されたことが確認できた.したがってグルコ-スー2ー ^<13>Cによる標識は有効であることがわかった.2.イミノプロトンのシグナルの分離をめざした ^<15>N標識 塩化アンモニウムー ^<15>Nを加えた合成培地を用いて50Lの培養を行ない,得られた大腸菌菌体から約500mgのtRNA粗分画を得た.これを,2段階のイオン交換クロマトグラフィ-によって精製し,およそ4mgのtRNA^<G1u>を得た.この[ ^<15>N]tRNA^<G1u>の500MHz ^1HーNMRスペクトルを測定し, ^<15>N核とのスピン結合によるイミノプロトンのシグナルの分裂から,90%以上が標識されたことを確認した.さらに,2次元 ^1Hー ^<15>N相関スペクトルを測定した結果,A・UおよびG・C塩基対に由来するイミノ窒素( ^<15>N)の化学シフトは互いに10ppmほど異なっており,容易に区別できることが分かった.

In this study, we developed a method for the identification of stable isotopes by NMR. This year<13>, <15><13>we have been pursuing the development of NMR techniques for identification of high efficiency. 1. We have been developing the identification of high efficiency tRNA for identification of high efficiency<13>. The method of identification rate is low, and the method of identification rate is low<13>. The <13>bacteria were cultured in 1L and RNA was extracted. This enzyme is used to decompose and refine four kinds of enzymes. ^<13>a b C d e d e 2<13>. <15>The identification of E. coli cells was obtained by the addition of <15>50L of synthetic culture medium. About 500mg of tRNA was obtained. 2-stage, 2-stage, 3-stage, 4-stage, 4-stage, 4<G1u>- 500 <15><G1u>MHz ^1H NMR of tRNA was used to determine the binding of tRNA to DNA, <15>and more than 90% of tRNA fragments were identified. In addition, 2-D ^1H ^<15>N correlation test results,A·U and G·C base pairs of origin of the chemical composition of the element ( ^<15>N) is 10ppm different, easy to distinguish between the two.

项目成果

Gota Kawai: "C1′ selective labeling of nucleic acids with [2ー ^<13>C]glucose in vivo" Journal of Biomdecular NMR.

Gota Kawai：“体内[2ー^13C]葡萄糖对核酸的C1选择性标记”Biomdeular NMR杂志。

Gota Kawai: "Separations of the iminoproton resonances of E.coli tRNA^<G1u> by in vivo ^<15>N labeling and heteronuclear NMR" Biochemistry.

Gota Kawai：“通过体内 ^ 15 N 标记和异核 NMR 分离大肠杆菌 tRNA ^ <G1u> 的亚氨基质子共振”生物化学。