安定同位体を利用したNMRによるRNAの立体構造解析法の開発

[1]複合標識オリゴヌクレオチドの調製 D-グルコース-^<13>C_6、塩化アンモニウム-^<15>Nを含む合成培地を用いて大腸菌を培養し、複合標識RNAを得た。これをRNaseT_1によって分解し、これまでに、^<13>C、^<15>Nによって複合標識されたモノヌクレオチド(Gp)およびジヌクレオチド(ApGp)を単離精製した。[2]核磁気共鳴の手法の開発 [1]で得られた複合標識ヌクレオチド(Gp、ApGpなど)を用いて、二重共鳴および三重共鳴NMRの測定を行うことにより、^<13>Cおよび ^<15>N核の化学シフトあるいは異核種間のスピン結合定数を決定することができた。[3]複合標識tRNAの立体構造解析 D-2-^<13>C-グルコース、塩化アンモニウム-^<15>Nを含む合成培地を用いて大腸菌を培養し、得られた菌体よりリボースの1'位が選択的 ^<13>C標識され、さらに ^<15>Nによって均一に標識されたtRNAを抽出し、HPLCをもちいてグルタミン酸に特異的なtRNA(tRNa^<Glu>)を精製した。得られた複合標識tRNA^<Glu>を用いて、H1'のNMRシグナルのみを選択的に観測する実験を行い、さらに、それを ^<13>C核の化学シフトで展開した二次元スペクトルを測定することに成功した。今後は、このようなtRNAを用いて、リボースシグナルの分解能を向上させ、それらの帰属、さらには構造情報を抽出を行う予定である。

[1]複合標識オリゴヌクレオチドの調製 D-グルコース-^<13>C_6、塩化アンモニウム-^<15>Nを含む合成培地を用いて大腸菌を培養し、複合標識RNAを得た。これをRNaseT_1によって分解し、これまでに、^<13>C、^<15>Nによって複合標識されたモノヌクレオチド(Gp)およびジヌクレオチド(ApGp)を単離精製した。[2]核磁気共鳴の手法の開発 [1]で得られた複合標識ヌクレオチド(Gp、ApGpなど)を用いて、二重共鳴および三重共鳴NMRの測定を行うことにより、^<13>Cおよび ^<15>N核の化学シフトあるいは異核種間のスピン結合定数を決定することができた。[3]複合標識tRNAの立体構造解析 D-2-^<13>C-グルコース、塩化アンモニウム-^<15>Nを含む合成培地を用いて大腸菌を培養し、得られた菌体よりリボースの1'位が選択的 ^<13>C標識され、さらに ^<15>Nによって均一に標識されたtRNAを抽出し、HPLCをもちいてグルタミン酸に特異的なtRNA(tRNa^<Glu>)を精製した。得られた複合標識tRNA^<Glu>を用いて、H1'のNMRシグナルのみを選択的に観測する実験を行い、さらに、それを ^<13>C核の化学シフトで展開した二次元スペクトルを測定することに成功した。今後は、このようなtRNAを用いて、リボースシグナルの分解能を向上させ、それらの帰属、さらには構造情報を抽出を行う予定である。