発生工学的手法によるマウス中胚葉誘導機構の解析

利用发育工程技术分析小鼠中胚层诱导机制

• 批准号: 06270206
• 负责人: 三木 清史
• 金额: $ 1.6万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-06270206/
• 关键词: mesoderm; ES cell; chimera mouse; cis-element; differentiation; P19; gene expression; morphogenesis

マウスの初期発生において、中胚葉は外胚葉から剥離した細胞が原条に移動する過程で形成される。この細胞分化と細胞運動を伴った形態形成は、カスケード形式で制御された多くの遺伝子が、組織および時期特異的に発現した結果であると考えられる。本研究ではBrachyury(T)遺伝子を中胚葉のマーカー遺伝子として捉え、マウスの胎児性癌細胞P19を用いたin vitroの系と胚操作によるin vivoの系で発現制御を解析することによって、中胚葉誘導機構の一端を遺伝子発現制御のレベルで明らかにすることを目的とした。P19細胞の分化系を利用してT遺伝子の発現制御に関わるシスエレメントを検索したところ、-340から下流にT遺伝子の基本的な発現誘導を指令するエレメントが、また-986から-340の間には、分化誘導2日目以降に発現を抑制するためのエレメントが存在することがわかった。次に-165〜-127の配列をプローブに用いたゲルシフトアッセイを行なった結果、未分化な細胞および3日間懸濁培養した細胞の粗核抽出液ではシフトせず、T遺伝子が発現している培養後2日目の粗核抽出液で特異的にシフトするバンドを検出した。フットプリントによってさらに解析を進めると、結合部位は-156から-143であることがわかった。これらP19細胞を用いたin vitroの実験とは別に、in vivoでも5'上流を解析するために-986までの領域を連結したLacZ遺伝子を胚幹細胞へ導入し、染色体へ組み込まれた細胞を株化した。この細胞株を用いてキメラマウスを作製し、子宮より取り出してX-gal染色で解析したところ、T遺伝子が発現する原条の領域で特異的に染色細胞が観察された。しかし、前後軸に沿った前部や脊索では染色された細胞を検出できなかった。この結果は、原条と脊索ではT遺伝子の発現が別々に制御されており、脊索での発現に必要なエレメントが5'上流-986までの領域以外に存在する可能性を示している。

During the early stage of development, mesoderm and ectoderm were separated and cells were moved. The cell differentiation and cell movement are accompanied by morphological formation, tissue formation and time-specific development. In this study, Brachyury(T) gene was used in the development and control of embryonic cells P19 in vitro and in vivo. P19 cell differentiation system uses T gene expression control system to realize the basic expression induction of T gene in the downstream of-340 cells. The results of the sequence analysis of-165 to-127 cells were as follows: undifferentiated cells were cultured in suspension for 3 days, crude nuclear extracts from cells were cultured in suspension for 3 days, T cells were produced, and crude nuclear extracts from cells cultured for 2 days were tested for specific sequence analysis. The position of the junction is-156 P19 cells are used in vitro, in vivo, in vitro and in vivo. The cell strain was isolated from the uterus by X-gal staining and detected by field-specific staining. The stained cells are detected along the anterior and posterior axes and the anterior and notochord. The results show that there is a possibility that the occurrence of T gene in the original strand and the middle strand is different from that in the original strand and the middle strand, and the occurrence of T gene in the middle strand and the middle strand is necessary.