発生工学的手法によるマウス中胚葉誘導機構の解析

利用发育工程技术分析小鼠中胚层诱导机制

基本信息

批准号：
06270206
负责人：
三木清史
金额：
$ 1.6万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-06270206/
关键词：
mesoderm ES cell chimera mouse cis-element differentiation P19 gene expression morphogenesis

项目摘要

マウスの初期発生において、中胚葉は外胚葉から剥離した細胞が原条に移動する過程で形成される。この細胞分化と細胞運動を伴った形態形成は、カスケード形式で制御された多くの遺伝子が、組織および時期特異的に発現した結果であると考えられる。本研究ではBrachyury(T)遺伝子を中胚葉のマーカー遺伝子として捉え、マウスの胎児性癌細胞P19を用いたin vitroの系と胚操作によるin vivoの系で発現制御を解析することによって、中胚葉誘導機構の一端を遺伝子発現制御のレベルで明らかにすることを目的とした。P19細胞の分化系を利用してT遺伝子の発現制御に関わるシスエレメントを検索したところ、-340から下流にT遺伝子の基本的な発現誘導を指令するエレメントが、また-986から-340の間には、分化誘導2日目以降に発現を抑制するためのエレメントが存在することがわかった。次に-165〜-127の配列をプローブに用いたゲルシフトアッセイを行なった結果、未分化な細胞および3日間懸濁培養した細胞の粗核抽出液ではシフトせず、T遺伝子が発現している培養後2日目の粗核抽出液で特異的にシフトするバンドを検出した。フットプリントによってさらに解析を進めると、結合部位は-156から-143であることがわかった。これらP19細胞を用いたin vitroの実験とは別に、in vivoでも5'上流を解析するために-986までの領域を連結したLacZ遺伝子を胚幹細胞へ導入し、染色体へ組み込まれた細胞を株化した。この細胞株を用いてキメラマウスを作製し、子宮より取り出してX-gal染色で解析したところ、T遺伝子が発現する原条の領域で特異的に染色細胞が観察された。しかし、前後軸に沿った前部や脊索では染色された細胞を検出できなかった。この結果は、原条と脊索ではT遺伝子の発現が別々に制御されており、脊索での発現に必要なエレメントが5'上流-986までの領域以外に存在する可能性を示している。

在小鼠的早期发育中，当细胞从外胚层迁移到条纹中时形成中胚层。这种形态发生伴随细胞分化和细胞运动性被认为是许多级联对照基因的组织和时序特异性表达的结果。在这项研究中，我们将Brachyury（T）基因视为中胚层标记基因，目的是通过使用小鼠胎儿癌细胞p19和通过Embryo操纵在体外进行体外系统中的体外系统中的表达控制来阐明基因表达控制水平的中胚层诱导机制的一端。当搜索使用p19细胞分化系统调节T基因表达涉及的顺式元件时，发现有一些元素可以指导T基因从-340下游的基本表达，以及-986和-340之间的元素，以抑制第二天的分化诱导后表达。 Next, a gel shift assay was performed using the sequences of -165 to -127 as a probe, and a band that specifically shifted in the crude nuclear extract of undifferentiated cells and cells cultured for 3 days was detected, but was not shifted in the crude nuclear extract of undifferentiated cells and cells cultured for 3 days, and was specifically shifted in the crude nuclear extract of crude nuclear extracts on the second day after culture where the T gene was表达。进一步的分析是通过足迹进行的，发现结合位点为-156至-143。除了使用这些p19细胞的体外实验外，还将与该区域相关的LACZ基因的5'上游引入到胚胎干细胞中，并衬有整合到染色体中的细胞中。使用该细胞系制备嵌合小鼠，从子宫中提取并通过X-GAL染色进行分析。在表达T基因的条纹区域中特别观察到染色的细胞。但是，沿着前轴的前轴和脊索无法检测到染色的细胞。该结果表明，T基因的表达在原子体和脊索中分别调节，并且在脊索中表达所需的元素可能存在于上游986上游的区域之外。