マウス中胚葉誘導における転写調節因子の検索

寻找小鼠中胚层诱导中的转录调节因子

基本信息

批准号：
07858083
负责人：
三木清史
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07858083/
关键词：
中胚葉転写調節遺伝子発現シスエレメント GATA因子

项目摘要

マウス中胚葉は、受精6.5日目頃に外胚葉から剥離した細胞が原条へ移動する過程で形成される。T遺伝子は原条の細胞で特異的に発現した後に脊索と尾芽に発現が限定される遺伝子である。申請者らは、中胚葉の分化とその形質維持に不可欠なT遺伝子を中胚葉細胞のマーカー遺伝子として捉え、その発現制御機構を胎児性癌細胞P19を用いて解析した。P19細胞をジメチルスルホキシド存在下で懸濁培養するとT遺伝子の発現が一過的に誘導されることから、5'上流域の欠失変異体にCAT遺伝子を連結したプラスミドを作製して発現制御領域を検索したところ、-299/-192と-192〜-128の2カ所にプロモーター活性を示す領域の存在が確認できた。これらの領域のDNAをプローブに用いてゲルシフト解析を行うと、それぞれの領域に結合するタンパク質が存在し、DNAとの結合活性の消長はT遺伝子の発現と同調していた。2つの領域のうち-192〜-128についてフットプリント解析を行ったところ、結合部位は-158〜-143の14bpであった。この部位に変異を導入するとプロモーター活性が消失することから、この配列が不可欠な制御エレメントとしてT遺伝子の発現に機能していることがわかった。また、その部位にはGATA因子の認識配列が含まれており、実際DMSO存在下で2日間懸濁培養したP19細胞には少なくともGATA2、3および4の発現が認められた。これらの結果から、GATA因子(群)が背腹軸の決定と連動して腹側中胚葉で何らかの機能をしていることが想定された。

当从外胚层分离到6.5天的受精约6.5天左右，从外胚层迁移到根系线时会形成小鼠中胚层。 T基因是一种在原蛋白细胞中特异性表达的基因，仅限于脊索和尾芽。申请人将T基因视为中胚层分化及其性状维持至关重要的T基因作为中胚层细胞的标记基因，并使用胎儿癌细胞p19分析了表达控制的机理。 Since T gene expression was transiently induced when P19 cells were cultured in the presence of dimethylsulfoxide, a plasmid was produced in which the CAT gene was linked to a deletion mutant in the upstream 5' and the expression control region was searched, and the presence of regions showing promoter activity was confirmed at two locations: -299/-192 and -192 to -128.当将来自这些区域的DNA用作探针时，进行了凝胶移位分析，并且存在与每个区域结合的蛋白质，并且与DNA结合活性的下降与T基因的表达一致。在两个区域的-192至-128上进行了足迹分析，结合位点为14 bp，范围从-158到-143。在该位点的突变引入导致启动子活性消失，并且发现该序列是T基因表达的必不可少的调节元件。此外，该位点包含GATA因子的识别序列，并且在DMSO存在的情况下，在悬浮液中培养的P19细胞中观察到了至少GATA2、3和4。这些结果表明，GATA因子（组）在腹侧中胚层中的功能与背腹轴的测定结合在一起。