蛋白質の吸着構造のH-D交換による解析法の開発

开发利用H-D交换的蛋白质吸附结构分析方法

• 批准号: 06276214
• 负责人: 河野 敬一
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-06276214/
• 关键词: ハイドロキシアパタイト; リゾチーム; オステオカルシン; 吸着; 重水素交換; NMR

固体表面において重要な働きをしている蛋白質の存在が近年知られるようになってきた。骨組織中のオステオカルシン等は無機質(ハイドロキシアパタイト)に吸着して骨組織の吸収・成長を制御しており骨粗しょう症のマーカーとしても有名である。幼若歯牙エナメル質に存在するアメロゲニンにも同様の働きが知られている。他にも固体表面における蛋白質の振る舞いが問題になる場合は多く、クロマトグラフィー担体への蛋白質の吸着様式、人工血管に対する血液蛋白の吸着等が挙げられる。これら吸着した蛋白質の吸着部位の同定と吸着コンフォメーションの解析は重要な課題でありながらこれまで方法論の困難さから研究はほとんど進展していない。我々はH-D交換と2次元NMRを組み合わせた新しい方法を開発した。すなわち吸着剤を充填したカラムに蛋白質の軽水溶液を流して吸着させ、中性の重水バッファーで置換することによってH-D交換反応を開始させる。一定時間インキュベートした後、酸性の重水バッファーを流して蛋白質を溶離させるとともに反応を停止させる。2次元NMRを測定することにより交換の遅くなったアミドプロトン即ち吸着部位を決定することができる。ハイドロキシアパタイトに対するニワトリリゾチームの吸着部位をこの方法で検討したところLys-13を中心とした正電荷の集団がアパタイト表面のリン酸基の負電荷と結合することが推定された。この結果を検証するためLys-13の側鎖をLeu-129のC端カルボキシル基とアミド結合させたところ、吸着の強さには変化がなかったことからLys-13の正電荷とC端の負電荷は塩橋を作ることによって打ち消しあっており吸着には直接寄与していないことがわかった。またCM-Toyopearlに対するニワトリリゾチームの吸着はアパタイトに対するよりも10倍強く吸着部位は複数の部位にわたっており、CM基が自由度を持っていることにより効果が考えられた。ヒトリゾチームのアパタイトに対する吸着は生理的にも重要であること、またニワトリと比べてArg-128が欠如していることから同様の実験を行ったところ、ヒトとニワトリはほぼ同じ結果であり、正電荷の密度がアパタイトに対する吸着において重要であることが示唆された。今後はオステオカルシン等のより生理的に重要な情報認識蛋白質に研究を広げていく予定である。

The existence of proteins on solid surfaces is known in recent years. The absorption and growth of bone tissue are controlled by the absorption of inorganic substances such as calcium in bone tissue. If the tooth quality exists, the tooth quality will be improved. There are many problems with protein vibration on solid surfaces, adsorption of protein on support, adsorption of blood protein on artificial blood vessels, etc. The determination of adsorption sites of proteins is an important subject for the analysis of adsorption problems. We are developing new methods for H-D exchange and 2D NMR. When the adsorption agent is filled, the protein and aqueous solution flow, adsorption, neutral and heavy water substitution, and H-D exchange reaction begin. After a certain period of time, the acid and heavy water will flow and the protein will be dissolved. 2-D NMR determination of the adsorption site A method for determining the adsorption site of a compound is proposed. The result is that the C-terminal of Lys-13 is blocked by the negative charge bridge of Lys-13. CM-Toyopearl is the most important component of the system. The density of positive charge is important for absorption. In the future, the important information of physiology and protein will be determined.