分子シャペロンを用いた蛋白質立体構造構築原理の解明

蛋白質の立体構造形成に関与し,生体内でも重要な役割を果しているシャペロニンGroE(GroEL,GroEs)の機能発現機構の詳細を調べ,蛋白質の構造形成反応の基本的原理の特徴を明らかにするため,様々な方法を用いて研究を行い,以下の点を明らかにした。1.シャペロニンGroEの構造-機能相関の研究大腸菌のシャペロニンを構成しているGroES分子の構造と機能について,CDと蛍光を用いて詳細に調べた。その結果,GroESは塩酸グアニジンや熱による変性はほぼ可逆的に起こり,機能も完全に回復することが明らかになった。また,CD測定からGroES分子の構造的特徴はβ-構造であることが判明した。さらに,GroESはGroELと複合体を形成すると熱に対して安定性をかなり増すことが分かった。2.シャペロニンの認識する構造形成中間体の特徴GroELは,基質蛋白質の再生中間体を認識する。この認識される中間体の構造特性を蛍光性プローブを用いて調べた。ネイティブ状態から熱によって形成させた中間体と変性剤中の変性状態から再生させた中間体は,いずれもGroELにトラップされた。これらの中間体の蛍光特性から疎水性に違いが見られた。このことから,GroEL分子は様々な中間体を認識するものと結論した。3.部位特異的変異導入によるシャペロニンの機能解析PCR法を駆使してGroEL蛋白質に導入した変異体を数種類(T89W,C138W,Y203C)作製し,その機能を解析した。基質蛋白質をトラップする結合能では,Wild>C138W>T89W=Y203Cであり,解離能ではWild=T89W>C138W>Y203Cであった。T89W変異体は他の変異体と異なり,ATPase活性を全く示さなかったが,基質蛋白質の構造形成を助けることから,シャペロニンはATPの加水分解エネルギーを基質蛋白質の構造形成に直接利用しているのではないことが明らかになった。

蛋白質の立体構造形成に関与し,生体内でも重要な役割を果しているシャペロニンGroE(GroEL,GroEs)の機能発現機構の詳細を調べ,蛋白質の構造形成反応の基本的原理の特徴を明らかにするため,様々な方法を用いて研究を行い,以下の点を明らかにした。1.シャペロニンGroEの構造-機能相関の研究大腸菌のシャペロニンを構成しているGroES分子の構造と機能について,CDと蛍光を用いて詳細に調べた。その結果,GroESは塩酸グアニジンや熱による変性はほぼ可逆的に起こり,機能も完全に回復することが明らかになった。また,CD測定からGroES分子の構造的特徴はβ-構造であることが判明した。さらに,GroESはGroELと複合体を形成すると熱に対して安定性をかなり増すことが分かった。2.シャペロニンの認識する構造形成中間体の特徴GroELは,基質蛋白質の再生中間体を認識する。この認識される中間体の構造特性を蛍光性プローブを用いて調べた。ネイティブ状態から熱によって形成させた中間体と変性剤中の変性状態から再生させた中間体は,いずれもGroELにトラップされた。これらの中間体の蛍光特性から疎水性に違いが見られた。このことから,GroEL分子は様々な中間体を認識するものと結論した。3.部位特異的変異導入によるシャペロニンの機能解析PCR法を駆使してGroEL蛋白質に導入した変異体を数種類(T89W,C138W,Y203C)作製し,その機能を解析した。基質蛋白質をトラップする結合能では,Wild>C138W>T89W=Y203Cであり,解離能ではWild=T89W>C138W>Y203Cであった。T89W変異体は他の変異体と異なり,ATPase活性を全く示さなかったが,基質蛋白質の構造形成を助けることから,シャペロニンはATPの加水分解エネルギーを基質蛋白質の構造形成に直接利用しているのではないことが明らかになった。