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時分割ラウエ法による酵素反応機構の動的解析実験法の開発

时间分辨劳厄法动态分析酶反应机理实验方法的开发

基本信息

批准号：
08214204
负责人：
畑安雄
金额：
$ 0.77万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

これまでに、470アミノ酸残基からなるセラライシン族亜鉛プロテアーゼである緑膿菌アルカリプロテアーゼの立体構造を決定し、N末端側活性ドメインとC末端側βヘリックスドメインの二つのドメインからなる分子であることを明らかにしてきた。結晶学的解析の次の段階として、阻害剤との複合体の構造を解析し、酵素自身の構造と比較して得られる構造変化に基づいて反応機構解析を行うのが通常の方法である。しかし、阻害剤を用いる方法を動的結晶構造解析に適用することはできない。そこで、反応機構を動的結晶解析により研究するため、pHジャンプによるトリガー法の開発を行うことにした。まず、動的解析の可能性を有する四残基からなるペプチド基質Z-A-G-G-L-OHと緑膿菌アルカリプロテアーゼとでペプチド基質を分解されない状態で酵素に結合させたミカエリスーメンテン型複合体結晶をpH5.6で調製し、その構造解析を行った。得られた結果は、pHジャンプ法での時分割結晶解析法を本複合体へ適用して酵素反応過程の動的研究を行うことの可能性を示唆するものであった。そこで、次に本複合体結晶のpHを結晶化pH(5.6)から至適pH(8.0)へジャンプさせて反応トリガーをかけることによって、この方法の適用を試みることにした。しかし、pHをジャンプさせることによる環境変化によって緑膿菌アルカリプロテアーゼの複合体結晶は溶解した。これを避けるためにグルタルアルデヒドによる結晶表面での分子間架橋法を用いることにし、条件検索を行った。その結果、0.25%グルタルアルデヒドに1時間浸漬して架橋した結晶の場合に得られたラウエ像は、この方法で調製した結晶の動的解析への適合性を支持するものであった。従って、この方法を用いれば、pHジャンプで白色ラウエ法による時分割動的結晶解析が可能になることが分かった。

The 3D structure of Pseudomonas aeruginosa was determined by the 470-mer acid residue, the N-terminal active residue, the C-terminal active residue, and the C-terminal active residue. The analysis of crystallography involves the following steps: analysis of the structure of the complex, analysis of the structure of the enzyme itself, comparison of the structure of the enzyme, analysis of the basic structure of the enzyme, and analysis of the reaction mechanism. The crystal structure analysis of the method used for the resistance analysis is applicable. Study on the Crystallization Analysis of the Reaction Mechanism and the Development of the Reaction Method The possibility of the analysis of the enzyme and the structure of the complex was analyzed. The four residues were separated from the substrate Z-A-G-G-L-OH and Pseudomonas aeruginosa. The substrate was decomposed into the middle state, the enzyme was combined with the substrate, and the structure of the complex was analyzed. The results showed that the pH value analysis method was suitable for the study of enzyme reaction process. The pH of crystallization of the complex was changed from pH(5.6) to pH(8.0). The complex crystals of Pseudomonas aeruginosa were dissolved when the pH value was changed. The intermolecular bridging method is used in the preparation of crystal surfaces. The results, 0.25%, and the suitability of the analytical solution for the modulation of crystal motion are supported by the results obtained in the case of immersion and bridging of crystals. The crystal analysis of the time-division method is possible due to the application of the method, pH value, and the separation of the crystal.