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放射光を利用した時間分割ラウエ法による酵素反応過程追跡実験法とトリガーの開発

开发使用同步辐射的时间分辨劳厄法跟踪酶反应过程的实验方法和触发器

基本信息

批准号：
06235207
负责人：
原田繁春
金额：
$ 1.02万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-06235207/
关键词：
金属プロテアーゼ X線結晶構造解析放射光ラウエ法

项目摘要

Strepto myces caespitosusが体対外に分泌する蛋白質分解酵素SCNPは、中性pH付近で活性が最大になるので中性プロテアーゼとも呼ばれている。132個のアミノ酸残基(分子量14,400)から成り、活性に必須の亜鉛原子を1個持つ、いわゆる金属プロテアーゼである。ラウエ法による動的構造解析法の開発を行なうため以下の研究を行なった。[1]ラウエ法で測定した回折強度データの精度の検討:inhibitorとSCNPの複合体結晶を使い、PFでラウエ法によるデータ測定とワイセンベルグカメラによる通常のデータ測定を行なった。叉、自動4軸回折計で測定したデータとの差フーリエを活性部位周辺で計算した。この実験からラウエ法では10msec以下でデータ測定ができ、単色X線の場合よりも精度はわるいがinhibitorの電子密度は十分に見れること、従って動的構造解析に使えることが確認出来た。[2]フローセルを使った実験:SCNPにEDTAを作用させると活性部位に存在する亜鉛が除かれ、分子構造が変化し、最終的には結晶が壊れてしまう。この分子構造の変化を見るためにフローセルを試作し、これにSCNPの結晶を詰め、EDTAを含む母液を流しながらラウエ法でデータ測定を行なった。結晶が30分から1時間で壊れるようにEDTAの濃度を設定した。データは100msecごとに10msecのX線照射を5回行なったものを1枚のIPに記録した。合計10枚のIPを使って50回の照射を行なった。最初の予測通り、測定開始から約30分後結晶は完全に壊れ、回折を示さなくなった。しかし、IPに写った回折点が少し尾を引いており、5回のshotに対応する5個の回折点の間隔が短かった為、うまくデータ処理が出来なかった。[3]SCNPの反応速度のコントロール:ラウエ法ではミリ秒オーダーでデータ測定が出来るが、それでもSCNPの酵素反応速度を遅くすることが出来たら時分割構造解析は容易になる。そこで、SCNPの活性に関与している亜鉛原子を他の金属イオンに置き換え活性を比較した。その結果、コバルトに置き換えるとnativeのものより活性が少し減少することがわかった。叉、これら金属置換体SCNPの結晶化に成功した。

Strepto myces caespitosus is secreted in vitro and its activity is highest at neutral pH 132 amino acid residues (MW 14,400) are required for the formation and activity of lead atoms. A study on the development of structural analysis method for dynamic analysis [1]A study on the accuracy of the method for determining the bending strength of SCNP:inhibitor and SCNP complex crystallization; PF method for determining the bending strength of SCNP complex; and general method for determining the bending strength of SCNP complex. 4-axis automatic folding meter to determine the difference between the active part of the calculation The electron density of the inhibitor is determined by the structural analysis of the electron density of the inhibitor in the case of color X-ray with the accuracy of 10msec or less. [2]SCNP has been found to be active in EDTA and its molecular structure has been transformed and finally crystallized. The molecular structure of SCNP was determined by the method of crystallization and EDTA. Crystallization time is 30 minutes and EDTA concentration is set. 100msec. X-ray irradiation 5 cycles. 1 IP record. A total of 10 IP shots were fired. After the initial measurement, the crystallization was completely completed and the reflection was completed about 30 minutes later. The interval between the 5 inflection points of IP is short, and the 5 inflection points of IP are short. [3]SCNP's reaction speed can be easily determined by the method of reaction speed analysis. The activity of SCNP is closely related to that of lead atoms and other metals. As a result, the activity of the native is reduced. Crystallization of SCNP was successfully carried out.