走査型電気化学顕微鏡(SECM)を用いた生体分子極微細構造の構築

使用扫描电化学显微镜（SECM）构建生物分子的超细结构

• 批准号: 08231206
• 负责人: 末永 智一
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08231206/
• 关键词: 走査型電気化学顕微鏡; ELISA; マイクロ電極; 微細加工; 抗原-抗体反応; ペルオキシダーゼ; SECM

本研究では,走査型電気化学顕微鏡(SECM)とエンザイムイムノアッセイ(ELISA)を組み合わせた新しい極微量・多項目計測法(SECM-ELISA)の開発,およびこのシステムをガンや妊娠の際に血液に放出されるタンパク質(抗原)であるhPL, hCGの極微量・局所検出に用いた.計測用基板として,微細加工方により2つの凸部(50μmx50μm)を作製したガラス基板を用いた.この基板の2つの凸部分に,2種の異なる抗体(抗HPLおよび抗HCG)を固定した後,測定対象物である抗原タンパク質を含む試料溶液1滴(0.01ml)を滴下した.次いで酵素(HRP)を標識固定した抗体の混合溶液に浸漬,洗浄後SECM測定を行い,局所タンパク質の2次元画像化を行った.計測用基板を,1.0mMフェロセニルメタノール(FMA)溶液中に浸漬し,探針電位を400mV vs Ag/AgClに設定しSECM観測を行うと,基板表面の凹凸に起因するFMAの酸化電流の二次元プロファイルが得られた.その後測定溶液に0.5mM H_2O_2を添加し,電位は50mV vsAg/AgClに保持し,SECM測定を行ったところ,それぞれ,対応する抗体が固定化された凸部のみで顕著な還元電流の増加が観察された.これは,この領域で抗原-HRP標識抗体複合体が生成し,HRPがH_2O_2によるFMAの酸化を触媒することによりFMA^+が生成したことを示している.従って,FMA^+の還元電流を画像化することにより,抗原の所在を特定し,さらに定量することができることが明らかとなった.このシステムを利用することにより,1滴の血液で100種以上の抗原の検出が可能であり,特に,乳幼児や老人など多量の採血が困難であり,反復計測が必要な場合の診断に有効な計測法であることが示された.

In this study, we investigated the development of a novel multi-item assay (SECM-ELISA) for the detection of trace amounts of hPL and hCG in blood during pregnancy. The measurement substrate is used for micromachining of 2 convex portions (50μ m x 50 μm). After fixing two kinds of antibodies (anti-HPL and anti-HCG) on the two convex parts of the substrate, one drop (0.01ml) of the sample solution containing the antigen was dropped. The secondary enzyme (HRP) was immobilized and the antibody was immersed in the mixed solution. After washing, the SECM was measured and the quality of the enzyme was analyzed. The substrate for measurement was immersed in a 1.0 mM FMA solution, and the probe potential was set to 400mV vs Ag/AgCl. During SECM measurement, the substrate surface roughness was caused by the FMA acidification current. After the addition of 0.5 mM H_2O_2, the potential was maintained at 50mV vs. Ag/AgCl, and the SECM assay was carried out. The antigen-HRP labeled antibody complex was produced in this field, and HRP was used as an acidifying catalyst for FMA. FMA^+ and the element current are characterized by the presence of specific antigens and by the presence of specific antigens. The detection of more than 100 antigens in one drop of blood is possible, especially in infants and elderly patients, and repeated measurement is necessary for diagnosis.

项目成果

H. Shiku: "Detection of Microspotted Carcioembryonic Antigen on a Glass Substrate by Scanning Electrochemical Microscopy." Anal. Chem.68. 1276-1278 (1996)

H. Shiku：“通过扫描电化学显微镜检测玻璃基底上的微斑点癌胚抗原。”

H. Shiku: "Dual Immunoassay of Human Chorionic Gonadotropin and Human Placental Lactogen at a Microfabricated Substrate by Scanning Electrochemical Microscopy." J. Electroanal. Chem.(印刷中).

H. Shiku：“通过扫描电化学显微镜对人绒毛膜促性腺激素和人胎盘催乳素进行双重免疫测定”。