カルシウムチャネル遺伝子欠損神経細胞を用いた伝達物質放出制御機構の解析

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(1)マウスCa^<2+>チャネル遺伝子の単離と塩基配列の決定マウスgenomic DNAライブラリーをウサギα_<1A>,α_<1B>,α_<1E>チャネルcDNAの5'側領域をプローブとしてスクリーニングすることによりマウスα_<1A>,α_<1B>,α_<1E>チャネルのアミノ末端側領域をコードする遺伝子をそれぞれ複数個単離した。そして得られたクローンの制限酵素地図の作製、エキソン領域の塩基配列の決定を行った。得られた塩基配列より推定したマウスα_<1A>,α_<1B>,α_<1E>チャネルの蛋白コーディングエキソン1アミノ酸配列をウサギのものと比べると全体としてアミノ酸配列は非常に良く似ているが、マウス/ウサギの個々のタイプのチャネル間において特に相同性が高かった。(2)ターゲットベクターの作製LoxPサイトで囲まれたネオマイシン耐性遺伝子(neo)(変異ES細胞クローン単離後Creリコンビナーゼでneo領域を抜き出し、これによるLacZハイブリッド遺伝子の発現に対する影響を除去する為)をES細胞スクリーニング用のマーカー遺伝子として用い、チャネル蛋白のアミノ酸配列と核移行シグナル付きβガラクトシダーゼ遺伝子(LacZ)のアミノ酸配列をフレームを合わせて連結し個々のチャネル蛋白の遺伝子発現制御機構によりβガラクトシダーゼ遺伝子の発現が制御されるようにした。(3)ES細胞(embryonic stem cells:マウス胚由来未分化細胞)へのターゲットベクターの導入と相同遺伝子組換えがおきた変異ES細胞クローンの単離ES細胞へのターゲットベクターの導入は電気穿孔法により行った。現在、目的とする相同遺伝子組換えがおきたクローンの単離、同定をPCR法とサザン法を併用して行っている。今後ひき続きブラストシスト(胚盤胞)内注入法によるキメラマウスの作成、引き続くF1マウス、欠損マウスの作成を行う予定である。