カルシウムチャネル遺伝子欠損神経細胞を用いた伝達物質放出制御機構の解析

利用钙通道基因缺陷神经元分析递质释放控制机制

• 批准号: 09259212
• 负责人: 田邊 勉
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Tokyo Medical and Dental University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09259212/
• 关键词: Ca^<2+>チャネル; ES細胞; 遺伝子ノックアウトマウス

(1)マウスCa^<2+>チャネル遺伝子の単離と塩基配列の決定マウスgenomic DNAライブラリーをウサギのα_<1A>,α_<1B>,α_<1E>チャネルcDNAの5'側領域をプローブとしてスクリーニングすることによりマウスα_<1A>,α_<1B>,α_<1E>チャネルのアミノ末端側領域をコードする遺伝子をそれぞれ複数個単離した。そしてそれらクローンの制限酵素地図の作製、エキソン領域の塩基配列の決定を行った。得られた塩基配列より推定したマウスα_<1A>,α_<1B>,α_<1E>チャネルのアミノ末端側のアミノ酸配列をウサギのα_<1A>,α_<1B>,α_<1E>チャネルと比較すると全体としてアミノ酸配列は非常に良く似ているが、マウスおよびウサギのそれぞれのタイプのチャネル間で特に相同性が高かった。(2)ターゲットベクターの作製Lox Pサイトで囲まれたネオマイシン耐性遺伝子をES細胞スクリーニング用のマーカー遺伝子として用い、チャネル蛋白のアミノ酸配列と核移行シグナル付きbガラクトシダーゼ遺伝子(lacZ)のアミノ酸配列をフレームを合わせて連結し個々のチャネル蛋白の遺伝子発現制御機構によりbガラクトシダーゼ遺伝子の発現が制御されるようにした。(3)チャネル遺伝子ノックアウトマウスの作成。ES細胞へのターゲットベクターの導入は電気穿孔法により行った。現在、2種類のチャネルについてES細胞へのターゲットベクターの導入と相同遺伝子組換えがおきた変異ES細胞クローンの単離を終了しており、その内の一種類においては、ブラストシスト(胚盤胞)内注入法によるキメラマウスの作成、F1マウスの作成を終了している。(4)今後、F1マウスの作成を終了したものに関しては今後引き続きノックアウトマウスの作成を行い、「研究目的」の欄に記載した実験を開始する。またその他の2種類のチャネルについてはさらに実験を進め早急にノックアウトマウスの作成を終了させる。

(1) チャネ ウスCa^<2+>チャネ 伝 derivatives 伝 単 from と bases are arranged to determine ウス ウスgenomic DNA ラ イ ブ ラ リ ー を ウ サ ギ の alpha _ < 1 >, alpha _ < b > 1, alpha _ < 1 > e チ ャ ネ ル cDNA の 5 'side of the field を プ ロ ー ブ と し て ス ク リ ー ニ ン グ す る こ と に よ り マ ウ ス alpha _ < 1 >, alpha _ < b > 1, alpha _ < 1 > e チ ャ ネ ル の ア ミ ノ end side of the field を コ ー ド す る heritage 伝 son を そ れ ぞ れ A plurality of 単 are separated from た. Youdaoplaceholder0 てそれら てそれら ロ ロ ロ ロ ロ <s:1> the map of restricted enzymes is prepared, エキソ the allocation of <s:1> bases in the <s:1> field is determined by を rows った. Have ら れ た salt base with column よ り presumption し た マ ウ ス alpha _ < 1 >, alpha _ < b > 1, alpha _ < 1 > e チ ャ ネ ル の ア ミ ノ end side の ア ミ ノ acid with column を ウ サ ギ の alpha _ < 1 >, alpha _ < b > 1, alpha _ < 1 > e チ ャ ネ ル と compare す る と all と し て ア ミ ノ acid with column は very good に く like て い る が, マ ウ ス お よ び ウ サ ギ の そ れ ぞ れ の タ イ プ の チ ャ ネ ル で te に phase between same-sex が high か っ た. (2)タ タ ゲットベ タ タ タ タ shall be made into Lox P サ イ ト で 囲 ま れ た ネ オ マ イ シ ン patience heritage 伝 を ES cells ス ク リ ー ニ ン グ with の マ ー カ ー posthumous son 伝 と し て い, チ ャ ネ ル protein の ア ミ ノ acid with column と nuclear migration シ グ ナ ル pay き b ガ ラ ク ト シ ダ ー ゼ heritage 伝 child (lacZ) の ア ミ ノ acid with column を フ レ ー ム を close わ せ て link し a 々 の チ ャ ネ ル protein の 伝 The subsidiary production corporation によ トシダ トシダ ゼ ゼ 伝 伝 subsidiary production が た た. (3) It was made by the 伝 offspring of チャネ, 伝, アウト, ウス and ウス. ES cells are then introduced into <s:1> electrical perforation タ ゲットベ <s:1> タ for った. Now, 2 species の チ ャ ネ ル に つ い て ES cells へ の タ ー ゲ ッ ト ベ ク タ ー の import と same heritage 伝 subgroups in え が お き た - different ES cells ク ロ ー ン の 単 from を end し て お り, そ の の within a species に お い て は, ブ ラ ス ト シ ス ト (blastoderm cell) injection method に よ る キ メ ラ マ ウ ス の is made, F1 マ ウ ス の made を end Youdaoplaceholder0 て る. (4) in the future, F1 マ ウ ス の is made at the end of を し た も の に masato し て は future lead き 続 き ノ ッ ク ア ウ ト マ ウ ス の made を い, recorded "research purposes" column の に し た be 験 を began す る. ま た そ の he の 2 kinds の チ ャ ネ ル に つ い て は さ ら に be 験 を into め early urgent に ノ ッ ク ア ウ ト マ ウ ス の made を end さ せ る.

项目成果

Adams,B.A. & Tanabe,T.: "Structural regions of the cardiac Ca channel α_<1C> subunit involved in Ca-dependent inactivation." J.Gen.Physiol.110. 379-389 (1997)

Adams, B.A. 和 Tanabe, T.：“心脏 Ca 通道 α_<1C> 亚基的结构区域参与 Ca 依赖性失活。”J.Gen.Physiol.110 (1997)。