カルシウムチャネル遺伝子欠損神経細胞を用いた伝達物質放出制御機構の解析

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(1)マウスCa^<2+>チャネル遺伝子の単離と塩基配列の決定マウスgenomic DNAライブラリーをウサギのα_<1A>,α_<1B>,α_<1E>チャネルcDNAの5'側領域をプローブとしてスクリーニングすることによりマウスα_<1A>,α_<1B>,α_<1E>チャネルのアミノ末端側領域をコードする遺伝子をそれぞれ複数個単離した。そしてそれらクローンの制限酵素地図の作製、エキソン領域の塩基配列の決定を行った。得られた塩基配列より推定したマウスα_<1A>,α_<1B>,α_<1E>チャネルのアミノ末端側のアミノ酸配列をウサギのα_<1A>,α_<1B>,α_<1E>チャネルと比較すると全体としてアミノ酸配列は非常に良く似ているが、マウスおよびウサギのそれぞれのタイプのチャネル間で特に相同性が高かった。(2)ターゲットベクターの作製Lox Pサイトで囲まれたネオマイシン耐性遺伝子をES細胞スクリーニング用のマーカー遺伝子として用い、チャネル蛋白のアミノ酸配列と核移行シグナル付きbガラクトシダーゼ遺伝子(lacZ)のアミノ酸配列をフレームを合わせて連結し個々のチャネル蛋白の遺伝子発現制御機構によりbガラクトシダーゼ遺伝子の発現が制御されるようにした。(3)チャネル遺伝子ノックアウトマウスの作成。ES細胞へのターゲットベクターの導入は電気穿孔法により行った。現在、2種類のチャネルについてES細胞へのターゲットベクターの導入と相同遺伝子組換えがおきた変異ES細胞クローンの単離を終了しており、その内の一種類においては、ブラストシスト(胚盤胞)内注入法によるキメラマウスの作成、F1マウスの作成を終了している。(4)今後、F1マウスの作成を終了したものに関しては今後引き続きノックアウトマウスの作成を行い、「研究目的」の欄に記載した実験を開始する。またその他の2種類のチャネルについてはさらに実験を進め早急にノックアウトマウスの作成を終了させる。