クロマチン構造を介した組換え反応の機能解析

染色质结构介导的重组反应的功能分析

基本信息

批准号：
09263219
负责人：
太田力
金额：
$ 1.28万
依托单位：
National Institute of Genetics
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09263219/
关键词：
クロマチン Mre11タンパク組換え

项目摘要

酵母の遺伝学的研究から相同組換えの最初の反応である二本鎖DNAの切断に関与すると考えられているMRE11遺伝子のアミノ末端にflag-tag(Asp-Tyr-Lye-Asp-Asp-Asp-Asp-Lyeの8個のアミノ酸)を付けたものを酵母で発現させflag-tagに対する抗体カラムを用いてMRE11蛋白質複合体を精製することに成功した。精製したMRE11蛋白質画分にはRAD50蛋白質も含まれていた。これはMRE11蛋白質とRAD50蛋白質が酵母の細胞内で蛋白質複合体を形成することを示唆したものである。このMRE11蛋白質複合体は一本鎖DNAおよび二本鎖DNAの切断活性を持つことが分かった。次に、MRE11蛋白質を大腸菌を用いて大量発現させNiアガロース、GSTセファロース、dsDNAセルロース、MonoS(FPLC)を用いて精製した。120kdの単一の蛋白質を得ることができた。MRE11蛋白質の抗体をもちいたwestern法でMonos画分をアッセイしたところ120kdのバンドが検出された。従って、この120kdの蛋白質はMRE11蛋白質であると思われる。精製したMRE11蛋白質は一本鎖DNA切断活性を持つことが分かった。平成10年度はこのMRE11蛋白質複合体の大量精製を行い、含まれる蛋白質の同定と生化学的解析を行うつもりである。精製したに組換えに関与する蛋白質複合体のなかには、今まで知られていない蛋白質の存在が予想される。そこで未知の蛋白質の機能を調べるためにその遺伝子のクローニングを行う。次に、得られたcDNAあるいはgenomicDNAを用いてその遺伝子の変異株を酵母で作成しin vivoでの機能を調べることを計画している。

The amino terminal of the MRE11 gene, which is thought to be involved in the first reaction of homologous recombination from yeast genetic studies, was marked as involved in the cleavage of double-stranded DNA, the first reaction of homologous recombination, with flag-tag (8 amino acids of Asp-Tyr-Lye-Asp-Asp-Asp-Asp-Lye) was expressed in yeast, and the MRE11 protein complex was successfully使用针对标志标签的抗体柱进行纯化。纯化的MRE11蛋白分数还包含RAD50蛋白。这表明MRE11蛋白和Rad50蛋白在酵母细胞中形成蛋白质复合物。发现该MRE11蛋白复合物具有单链和双链DNA裂解活性。接下来，使用大肠杆菌大量表达MRE11蛋白，并使用Ni琼脂糖，GST Sepharose，DsDNA纤维素和Monos（FPLC）纯化。获得了120KD的单一蛋白质。当使用西部方法使用对MRE11蛋白的抗体测定单声道馏分时，检测到120 kD的带。因此，这种120kD蛋白似乎是MRE11蛋白。发现纯化的MRE11蛋白具有单链DNA裂解活性。 1998年，我们打算对这种MRE11蛋白质复合物进行大规模纯化，以识别其中包含的蛋白质和生化分析。在纯化和重组蛋白复合物中预测了先前未知的蛋白质的存在。因此，将基因克隆来研究未知蛋白的功能。接下来，我们计划使用所获得的cDNA或基因组DNA在酵母中创建基因的突变菌株，以检查其在体内的功能。