クロマチン構造を介した組換え反応の機能解析

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酵母の遺伝学的研究から相同組換えの最初の反応である二本鎖DNAの切断に関与すると考えられているMRE11遺伝子のアミノ末端にflag-tag(Asp-Tyr-Lye-Asp-Asp-Asp-Asp-Lyeの8個のアミノ酸)を付けたものを酵母で発現させflag-tagに対する抗体カラムを用いてMRE11蛋白質複合体を精製することに成功した。精製したMRE11蛋白質画分にはRAD50蛋白質も含まれていた。これはMRE11蛋白質とRAD50蛋白質が酵母の細胞内で蛋白質複合体を形成することを示唆したものである。このMRE11蛋白質複合体は一本鎖DNAおよび二本鎖DNAの切断活性を持つことが分かった。次に、MRE11蛋白質を大腸菌を用いて大量発現させNiアガロース、GSTセファロース、dsDNAセルロース、MonoS(FPLC)を用いて精製した。120kdの単一の蛋白質を得ることができた。MRE11蛋白質の抗体をもちいたwestern法でMonos画分をアッセイしたところ120kdのバンドが検出された。従って、この120kdの蛋白質はMRE11蛋白質であると思われる。精製したMRE11蛋白質は一本鎖DNA切断活性を持つことが分かった。平成10年度はこのMRE11蛋白質複合体の大量精製を行い、含まれる蛋白質の同定と生化学的解析を行うつもりである。精製したに組換えに関与する蛋白質複合体のなかには、今まで知られていない蛋白質の存在が予想される。そこで未知の蛋白質の機能を調べるためにその遺伝子のクローニングを行う。次に、得られたcDNAあるいはgenomicDNAを用いてその遺伝子の変異株を酵母で作成しin vivoでの機能を調べることを計画している。