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複製開始蛋白質の二量体から単量体変換における分子シャペロンの作用機構の解析

分子伴侣在复制起始蛋白二聚体向单体转化中的作用机制分析

基本信息

批准号：
07253213
负责人：
和田千恵子
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1)大腸菌を宿主として複製するミニFの複製開始頻度は厳密に調節されている。この調節にはミニFの複製開始蛋白質(RepE)が重要な働きをしている。RepEは複製開始因子として、また自己転写抑制因子としての機能を持つ。この特徴は多くの複製開始因子に共通する。我々はこれまでの解析から、RepEのイニシエーター/リプレッサーの機能転換は単量体、二量体の構造変換として理解出来ることを明かにした。この変換に分子シャペロンが関与しているという示唆的データーを得ていたが,このことを精製RepEを用いた実験系を作り、確証する試みをした。マイクロコンによる分子篩法を用いると、単量体(分子量30kDa)は濾液に80〜100%回収されるが、正常RepE(二量体、分子量60kDa)は濾液に3〜7%しか回収されない。しかし4M Guanidine塩酸であらかじめ正常RepEを処理したり、分子シャペロン(DnaK, DnaJ, GrpE)とATPで処理すると濾液に前者は78%,後者は42%回収された。正常RepEが濾液に回収されるにはDnaK, DnaJ, GrpEとATPが必要であること、またこの濾液のゲル濾過カラム溶出パターンから単量体RepEであることを明らかにした。この結果はRepE二量体が分子シャペロン(DnaK, DnaJ, GrpE)とATPによってRepE単量体に変換されることを示している。in vivoにおいても、人工的に細胞内の分子シャペロンの量を増すとRepEのイニシエーター活性が増加することがわかった。このことはRepEのイニシエーター機能の活性化に分子シャペロンが働いていることを示している。2) RepEと分子シャペロンとの相互作用領域、DNA結合ドメイン、二量体形成ドメインを明かにし、分子シャペロンによるRepEの高次構造変化と活性化の機構を分子レベルで明かにするためにはRepEの機能ドメインの解析データーが必須である。RepEのDNA結合ドメインを遺伝学的手法により決めるためにrepE遺伝子の全領域に均一に変異を誘導し、複製開始領域にもオペレーターにも結合出来なくなった変異体を系統的に分離、解析した結果、C末端領域がDNA結合に関与していることを明かにした。

1)The frequency of replication initiation in E. coli hosts is closely regulated. This regulatory protein, RepE, is essential for the development of this disease. RepE copy start factor and self-write inhibition factor These characteristics are common to many replication initiation factors. I am going to analyze and analyze the function of RepE, and change the structure of single volume and double volume. This is the first time I've ever seen a person who's been in a relationship with someone who's been in a relationship with someone else. The molecular sieve method is used in the middle and low molecular weight (molecular weight 30kDa), the filtrate is 80 ~ 100% recovered, and the normal RepE(molecular weight 60kDa) is 3 ~ 7% recovered. 4M Guanidine acid treatment was 78% and 42% for the former and the latter for the latter. The normal RepE is the filtrate that is dissolved in DnaK, DnaJ, GrpE and ATP. The results showed that the RepE molecules (DnaK, DnaJ, GrpE) and ATP molecules were different. In vivo, the amount of molecules in the cell increases. This is the first time I've ever seen a woman. 2)RepE and RepE molecular interaction domain, DNA binding agent, dimer formation agent, molecular selection agent, RepE high-order structural transformation and activation mechanism, molecular transformation agent, RepE functional analysis agent must be identified. RepE DNA binding technology is used to determine whether repE DNA binding is related to the whole domain, whether it is induced uniformly, whether it is copied in the initial domain, whether it is related to DNA binding in the C-terminal domain, whether it is isolated from the heterogeneic system, whether it is analyzed in the C-terminal domain, or whether it is related to DNA binding in the C-terminal domain.