大腸菌ミニF複製制御機構の解析

大腸菌を宿主として複製するミニFの複製開始蛋白質RepEは複製開始頻度の調節のKEY ELEMENTとして注目されているが詳細な機構は明かでない。我々はRepEが持つ二つの機能(イニシエーター、リプレッサー)は各々RepE単量体と二量体に対応しており、イニシエーター/リプレッサーの機能変換が単量体と二量体の構造変換として理解出来る事を明きらかにした。この二量体から単量体への変換に分子シャペロン(DnaK,DnaJ,GrpE)が関与している可能性を今年度検討した。さらにミニFのコピー調節におけるincC領域の役割を研究する計画をしていたが、ミニFの試験管内DNA合成系の準備をしたにとどまった。然し、RepEのドメインに関して重要な進展があった。今年度の研究実績を以下に記す。(1)正常RepEの複製開始領域(DR)、オペレーター(IR)への結合に及ぼすDnak,DnaJの効果をDR又はIRのDNAをプローブにして精製RepE,DnaK,DnaJを用いてゲルシフトAssayで調べた。RepEのDRへの結合能はDnaK,DnaJ,ATPの量に比例してDRへの結合能が増大する事が明かとなり、RepE二量体がDnaK,DnaJ,ATPにより単量体に変換される事が示唆された。(2)細胞粗抽出液からニッケルアフィニティカラム、架橋剤を用いてRepEと分子シャペロンとの複合体を見つけることが出来た。(3)RepEの種々の変異体を用いて分子シャペロン(DnaK,DnaJ)との複合体の形成能を調べることにより、RepEの分子シャペロンとの相互作用領域を決定した。(4)oriCDNA複製がみられるフラクションIIが調整出来た。RepEに依存したミニFの複製が行われるかどうか?DnaK,DnaJ,GrpEによって促進されるかどうか?等を今後調べる予定である。(5)RepEの複製開始領域(DR),オペレーター(IR)への結合に関与する領域の決定:RepE遺伝子にPCRによりランダムに変異を導入し、DNA結合能を失った変異体だけを選択できる系を作り、系統的に解析した結果、RepEのC末領域に変異体が集中し、この領域がDNA結合ドメインであろうと結論した。(J.Bact.,1995,4月号掲載予定)

大腸菌を宿主として複製するミニFの複製開始蛋白質RepEは複製開始頻度の調節のKEY ELEMENTとして注目されているが詳細な機構は明かでない。我々はRepEが持つ二つの機能(イニシエーター、リプレッサー)は各々RepE単量体と二量体に対応しており、イニシエーター/リプレッサーの機能変換が単量体と二量体の構造変換として理解出来る事を明きらかにした。この二量体から単量体への変換に分子シャペロン(DnaK,DnaJ,GrpE)が関与している可能性を今年度検討した。さらにミニFのコピー調節におけるincC領域の役割を研究する計画をしていたが、ミニFの試験管内DNA合成系の準備をしたにとどまった。然し、RepEのドメインに関して重要な進展があった。今年度の研究実績を以下に記す。(1)正常RepEの複製開始領域(DR)、オペレーター(IR)への結合に及ぼすDnak,DnaJの効果をDR又はIRのDNAをプローブにして精製RepE,DnaK,DnaJを用いてゲルシフトAssayで調べた。RepEのDRへの結合能はDnaK,DnaJ,ATPの量に比例してDRへの結合能が増大する事が明かとなり、RepE二量体がDnaK,DnaJ,ATPにより単量体に変換される事が示唆された。(2)細胞粗抽出液からニッケルアフィニティカラム、架橋剤を用いてRepEと分子シャペロンとの複合体を見つけることが出来た。(3)RepEの種々の変異体を用いて分子シャペロン(DnaK,DnaJ)との複合体の形成能を調べることにより、RepEの分子シャペロンとの相互作用領域を決定した。(4)oriCDNA複製がみられるフラクションIIが調整出来た。RepEに依存したミニFの複製が行われるかどうか?DnaK,DnaJ,GrpEによって促進されるかどうか?等を今後調べる予定である。(5)RepEの複製開始領域(DR),オペレーター(IR)への結合に関与する領域の決定:RepE遺伝子にPCRによりランダムに変異を導入し、DNA結合能を失った変異体だけを選択できる系を作り、系統的に解析した結果、RepEのC末領域に変異体が集中し、この領域がDNA結合ドメインであろうと結論した。(J.Bact.,1995,4月号掲載予定)