生物時計分子の核内移行と概日リズム

生物钟分子的核易位和昼夜节律

• 批准号: 11237205
• 负责人: 内匠 透
• 金额: $ 41.22万
• 依托单位: Osaka Bioscience Institute (2001-2003)Kobe University (1999-2000)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11237205/
• 关键词: 時計蛋白; 概日リズム; 核移行; 遺伝子; 神経科学; 生理学; 脳・神経; 時計分子; 時計遺伝子; 視交又上核

培養細胞を用いた実験等から、CRYとPERとの核移行が、転写のフィードバック機構の本体を調節し、時間の決定機構となるという仮説をたて、時計分子の核移行の詳細な分子機構を検討した。CRY2には典型的な核移行シグナルNLSがカルボキシル端側に存在するが、CRY1には定型的NLSが存在しない。CRY1,CRY2をタグ付きGST融合蛋白として大腸菌にて発現、精製した蛋白をMH3T3培養細胞に注入することによりその核移行を検討した。CRY1,CRY2蛋白の細胞質内注入後、両者とも核内への移行がみられたが、WGA, Ran-GTP, G19V Ran-GTP等との共注入実験を行った所、同じく両者ともRan依存性に核移行することが明らかになった。さらに、CRY1,CRY2をそれぞれN末側C末側に二分割したCRY1N, CRY1C, CRY2N, CRY2Cを、同様に大腸菌を用いて蛋白を発現、精製し、細胞注入した結果、いずれもN末端側蛋白(CRY1N, CRY2N)は核移行を示さず、C端側(CRY1C, CRY2C)は核移行を観察した。セミインタクト細胞を用いたin vitro系では、CRY1C, CRY2Cともにimportinαβを介する核移行を行っていることが示された。NLS配列をもつCRY2Cの核移行はin vitro結合実験の結果からもimportinαβを介する核移行であることを明らかにした。さらに、CRY2のNLSの変異体では核移行が阻害されたことから、CRY2の核移行に必須であることを明らかにした。

The cell is required to use the equipment such as the telephone, the CRY, the PER, the main body of the machine, the time-determining mechanism, and the molecular counterpart of the computer. CRY2 is typical of nuclear migration. There is a typical NLS that is typified by nuclear migration. There is a NLS that is typed by CRY1. The GST fusion protein (GST) was injected into the cells of E. coli by MH3T3 culture. After the CRY1,CRY2 protein was injected into the cell, the cells were transferred into the nuclei of the mice, WGA, Ran-GTP, G19V Ran-GTP and so on, which were co-injected into the cell, and the patients with the same gene were injected with Ran-dependent nuclear transfer cells. The results of CRY1N, CRY1C, CRY2N, CRY2C, CRY1N, CRY1C, CRY2N, CRY2C, cell injection, N-terminal protein (CRY1N, CRY2N) and C-terminal (CRY1C, CRY2C) nuclear migration were detected by RT-PCR, DNA sequencing, cell injection assay, N-terminal protein (NTP) nuclear migration assay and C-terminal nuclear migration assay. The cells were labeled with in vitro, CRY1C, CRY2C, importin α β, nuclear migration, cell cycle, and cell cycle. NLS is equipped with the combination of importin α β, importin α and in vitro. The results show that there is no significant difference between the two groups. It is necessary for the CRY2 NLS system to prevent the nuclear transfer, and for the CRY2 nuclear transfer to be clear.

项目成果

Takumi,T.: "Rapid cDNA cloning by PCR screening"Methods Mol.Biol.. (in press).

Takumi,T.：“通过 PCR 筛选快速克隆 cDNA”Methods Mol.Biol..（正在出版）。

Maebayashi Y. et al.: "A putative transcription Factor with seven zinc-finger motifs identified in the developing suprachiasmatic nucleus by the differential display PCR method"The Journal of Neuroscience. 19・22. 10176-10183 (1999)

Maebayashi Y.等人：“通过差异显示PCR方法在发育中的视交叉上核中鉴定出具有七个锌指基序的推定转录因子”《神经科学杂志》19·22（1999）。

Y.Kajimoto, O.Shirakawa, X.-H.Lin, T.Hashimoto, N.Kitamura, N.Murakami, T.Takumi, K.Maeda: "Synapse-associated protein 90/postsynaptic density-95-asssociated protein (SAPAP) is expressed differentially in phencyclidine-treated rats and is increased in the

Y.Kajimoto、O.Shirakawa、X.-H.Lin、T.Hashimoto、N.Kitamura、N.Murakami、T.Takumi、K.Maeda：“突触相关蛋白 90/突触后密度 95 相关蛋白（

Prevot V. et al.: "Evidence that members of the TGF-β superfamily play a Keyrole in the regulation of the GnRH neuroendocrine axis: expression of a type1 serine-threonine kinase receptor"Journal of Neuroendocrinology. (in press). (2000)

Prevot V. 等人：“TGF-β 超家族成员在 GnRH 神经内分泌轴调节中发挥关键作用的证据：1 型丝氨酸-苏氨酸激酶受体的表达”《神经内分泌学杂志》（2000 年出版）。 ）

S.Bouret, M.T.V.Chuoi-Mariot, V.Prevot, D.Croix, T.Takumi, S.Jegou, H.Vaudry, J.-C.Beauvilain, V.Mitchell: "Evidence that TGF-b may directly modulate POMC mRNA expression in the female rat arcuate nucleus"Endocrinology. 142. 4055-4065 (2001)

S.Bouret、M.T.V.Chuoi-Mariot、V.Prevot、D.Croix、T.Takumi、S.Jegou、H.Vaudry、J.-C.Beauvillain、V.Mitchell：“TGF-b 可能直接调节 POMC 的证据