ADAMファミリーメンバーのクローニングと機能解析

ADAM15:ヒトADAM15のバリアント:細胞内ドメインに25個とそれに続く24個計49個のアミノ酸の挿入配列を持つADAM15v1とADAM15v2を見出した。この細胞内配列はプロリンに富むクラスIIおよびクラスIのSH3結合配列から成り、ADAM12の細胞内ドメインのそれに酷似するが、ADAM15v2はこの配列をタンデムに持つことからより強力な構造である。このバリアントmRNAはT細胞およびマクロファージに強く発現している。ADAM15v2のSH3結合配列に対する単クローン抗体(mAb)を作成し、免疫沈降法でバリアント蛋白の発現を確認した。マウスのADAM15遺伝子の全塩基配列を決定し、イントロン19内に同様のバリアントが存在することを確認した。マウスのADAM15v2は24個のSH3結合配列はクラスIIの1個のコンセンサス配列の違いから、クラスIのみの配列である。ヒトおよびマウスのADAM15v2とSrcファミリー蛋白との結合性や結合度をADAM15のそれと比較検討するために、Lck、Hck-GST蛋白、非燐酸化および燐酸化ADAM15およびADAM15v2HIS蛋白を作成しプルダウン法および免疫沈降法でADAM15v2がより強く、また、燐酸化蛋白がより強く反応することを確認した。さらに、非燐酸化および燐酸化ADAM15およびADAM15v2GST蛋白を作成し,抗LckあるいはHck抗体を用いてJurkat細胞やHL60細胞のLckあるいはHckが燐酸化ADAM15v2により強く反応することを確認した。また、マウスのEL4細胞では類似の方法で燐酸化LckおよびSrcが強く反応することを確認した。また、JurkatやEL4細胞をミリスチン酸や抗CD3抗体刺激で燐酸化ADAM15v2により強く反応することを観察した。Jurkat細胞では抗CD3抗体刺激でLFA-1とICAM-1の結合が亢進するが、この反応がBioporterを用いた抗ADAM15v2mAbの細胞内注入により阻害されることを確認した。(2)ADAM8(CD156):ADAM8のstabl transfectantを293T細胞に作成し、これに、TNF-α,HB-EGF,L-selectin,FasL,CD44などをtransient transfectし、免疫沈降法でTNF-αおよびHB-EGFが遊離されること(shedding)を確認した。TNF-αでは遊離をELISA法でも確認した。細胞内ドメインにはクラスIIおよびクラスI配列が存在し、これらにHckやLckが強く反応することを観察した。

ADAM15:ヒトADAM15のバリアント:細胞内ドメインに25個とそれに続く24個計49個のアミノ酸の挿入配列を持つADAM15v1とADAM15v2を見出した。この細胞内配列はプロリンに富むクラスIIおよびクラスIのSH3結合配列から成り、ADAM12の細胞内ドメインのそれに酷似するが、ADAM15v2はこの配列をタンデムに持つことからより強力な構造である。このバリアントmRNAはT細胞およびマクロファージに強く発現している。ADAM15v2のSH3結合配列に対する単クローン抗体(mAb)を作成し、免疫沈降法でバリアント蛋白の発現を確認した。マウスのADAM15遺伝子の全塩基配列を決定し、イントロン19内に同様のバリアントが存在することを確認した。マウスのADAM15v2は24個のSH3結合配列はクラスIIの1個のコンセンサス配列の違いから、クラスIのみの配列である。ヒトおよびマウスのADAM15v2とSrcファミリー蛋白との結合性や結合度をADAM15のそれと比較検討するために、Lck、Hck-GST蛋白、非燐酸化および燐酸化ADAM15およびADAM15v2HIS蛋白を作成しプルダウン法および免疫沈降法でADAM15v2がより強く、また、燐酸化蛋白がより強く反応することを確認した。さらに、非燐酸化および燐酸化ADAM15およびADAM15v2GST蛋白を作成し,抗LckあるいはHck抗体を用いてJurkat細胞やHL60細胞のLckあるいはHckが燐酸化ADAM15v2により強く反応することを確認した。また、マウスのEL4細胞では類似の方法で燐酸化LckおよびSrcが強く反応することを確認した。また、JurkatやEL4細胞をミリスチン酸や抗CD3抗体刺激で燐酸化ADAM15v2により強く反応することを観察した。Jurkat細胞では抗CD3抗体刺激でLFA-1とICAM-1の結合が亢進するが、この反応がBioporterを用いた抗ADAM15v2mAbの細胞内注入により阻害されることを確認した。(2)ADAM8(CD156):ADAM8のstabl transfectantを293T細胞に作成し、これに、TNF-α,HB-EGF,L-selectin,FasL,CD44などをtransient transfectし、免疫沈降法でTNF-αおよびHB-EGFが遊離されること(shedding)を確認した。TNF-αでは遊離をELISA法でも確認した。細胞内ドメインにはクラスIIおよびクラスI配列が存在し、これらにHckやLckが強く反応することを観察した。