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ADAMファミリーメンバーのクローニングと機能解析

ADAM家族成员的克隆及功能分析

基本信息

批准号：
11240205
负责人：
山本俊輔
金额：
$ 26.88万
依托单位：
Beppu University (2003)大分医科大学 (1999-2002)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

ADAM15:ヒトADAM15のバリアント:細胞内ドメインに25個とそれに続く24個計49個のアミノ酸の挿入配列を持つADAM15v1とADAM15v2を見出した。この細胞内配列はプロリンに富むクラスIIおよびクラスIのSH3結合配列から成り、ADAM12の細胞内ドメインのそれに酷似するが、ADAM15v2はこの配列をタンデムに持つことからより強力な構造である。このバリアントmRNAはT細胞およびマクロファージに強く発現している。ADAM15v2のSH3結合配列に対する単クローン抗体(mAb)を作成し、免疫沈降法でバリアント蛋白の発現を確認した。マウスのADAM15遺伝子の全塩基配列を決定し、イントロン19内に同様のバリアントが存在することを確認した。マウスのADAM15v2は24個のSH3結合配列はクラスIIの1個のコンセンサス配列の違いから、クラスIのみの配列である。ヒトおよびマウスのADAM15v2とSrcファミリー蛋白との結合性や結合度をADAM15のそれと比較検討するために、Lck、Hck-GST蛋白、非燐酸化および燐酸化ADAM15およびADAM15v2HIS蛋白を作成しプルダウン法および免疫沈降法でADAM15v2がより強く、また、燐酸化蛋白がより強く反応することを確認した。さらに、非燐酸化および燐酸化ADAM15およびADAM15v2GST蛋白を作成し,抗LckあるいはHck抗体を用いてJurkat細胞やHL60細胞のLckあるいはHckが燐酸化ADAM15v2により強く反応することを確認した。また、マウスのEL4細胞では類似の方法で燐酸化LckおよびSrcが強く反応することを確認した。また、JurkatやEL4細胞をミリスチン酸や抗CD3抗体刺激で燐酸化ADAM15v2により強く反応することを観察した。Jurkat細胞では抗CD3抗体刺激でLFA-1とICAM-1の結合が亢進するが、この反応がBioporterを用いた抗ADAM15v2mAbの細胞内注入により阻害されることを確認した。(2)ADAM8(CD156):ADAM8のstabl transfectantを293T細胞に作成し、これに、TNF-α,HB-EGF,L-selectin,FasL,CD44などをtransient transfectし、免疫沈降法でTNF-αおよびHB-EGFが遊離されること(shedding)を確認した。TNF-αでは遊離をELISA法でも確認した。細胞内ドメインにはクラスIIおよびクラスI配列が存在し、これらにHckやLckが強く反応することを観察した。

ADAM15: ヒトADAM15のバリアント: Intracellular ドメインに25とそれに続く24 A total of 49 pieces of ADAM15v1 and ADAM15v2 are inserted into the array. Intracellular arrangement of SH3 binding arrangement, ADAM12 intracellular arrangementドメインのそれに resembles するが, ADAM15v2 はこのmatching をタンデムにhold つことからよりstrong である.このバリアントmRNAはT cell およびマクロファージにstrong く発成している. The SH3 binding sequence of ADAM15v2 was prepared and the antibody (mAb) was prepared and the protein was confirmed by immunoprecipitation method. The complete base arrangement of the マウスのADAM15 remains has been decided, and the existence of the イントロン19 same type as the のバリアントが has been confirmed.マウスのADAM15v2は24 pieces of SH3 combination arrangement はクラスIIの1のコンセンサス配arrayのviolationいから, クラスIのみの配arrayである. ADAM15v2 ADAM15v2 AD AM15のそれとComparison of するために, Lck, Hck-GST protein, non-phosphonic acid ADAM15 およびADAM15v2HIS protein was made by しプルダウン method and immunoprecipitation The method of ADAM15v2 is strong and strong, and the acidified protein is strong and strong, and it is confirmed by the reaction. Made of さらに, non-phosphorylated ADAM15 およびADAM15v2GST protein, anti-Lck あるいはHck antibody is usedいてJurkat cells やHL60 cells のLck あるいはHck が琐 acidified ADAM15v2 によりstrong く濜することをconfirmed した. A similar method is used for EL4 cells of また and マウスのEL4 cells. The acidification of Lck and Src is strong and the reaction is confirmed by the method.また, Jurkat's EL4 cells were stimulated by anti-CD3 antibodies, and ADAM15v2 was stimulated to react with strong anti-CD3 antibodies. The binding of LFA-1 and ICAM-1 to Jurkat cells stimulated by anti-CD3 antibodies is enhanced and the reaction is stimulated. Bioporter confirmed the use of intracellular injection of anti-ADAM15v2 mAb and the blocking of anti-ADAM15v2 mAb. (2)ADAM8 (CD156): ADAM8's stable transfectant, 293T cells, TNF-α, HB-EGF, L-selectin, FasL, CD44, transient transfect, immunoprecipitation method, TNF-α, HB-EGF, free, confirmed. TNF-α has been free and confirmed by ELISA. Intracellular ドメインにはクラスII およびクラスI arrangement が presence し, これらにHck やLck がstrong くすることを観 Observation した.