病原体産物に対する生体反応の中枢分子CD14の機能と機能解析に関する研究

病原体产物生物反应的中心分子CD14的功能及功能分析研究

• 批准号: 08282230
• 负责人: 山本 俊輔
• 金额: $ 1.92万
• 依托单位: 大分医科大学
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 1997
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08282230/
• 关键词: CD14; LPS; サイトカイン; NOシンターゼ; トランスジェニックマウス; ノックアウトマウス; リコンビナント蛋白; エンドトキシンショック

1)1.ラットCD14(rCD14)cDNAの分離と一次構造の特徴:rCD14cDNAを分離した。2.rCD14および生理活性因子発現のカイネティクス検索:Kupffer細胞(KC)は他のMPS細胞とは異なるCD14およびCKの発現を示すこと、LPSによるCD14系のトリガーは少数の膜CD14により引かれること、upregulateされたCD14はLPSの清掃分子として機能すること、KCのTNF-α以外の生理活性因子遊離機能は乏しくLPSの清掃細胞として機能することなどが示唆された。2).CD14遺伝子操作マウスにおけるLPS反応性解析:1.トランスジェニックマウス(TM)の解析:1:膜型および非膜型mCD14TM:膜型および非膜型mCD14TMを作出した(M14MおよびM14S)。M14MおよびM14SではLPS(20μg/mouse)刺激後の血中TNF-αおよびIL-6レベルが有意に低値を示すこと、LPSによる致死性Shwartzman反応が有意に阻止されることなどを観察した。異所性CD14がLPS傷害に防御的に働くことやsoluble CD14にES阻止および促進の両面作用があることが示唆された。(2)mCD14N末端部アミノ酸71個をコードするTMの作出:mCD14のN末端71個のアミノ酸(N71)をコードするTMを肝に特異的に発現するTM(AT-N71)を作出した・2.mCD14ノックアウト(KO)マウスの解析:KOマウスではLPS刺激による末梢血単球からのCK産生は全く見られない。LPS投与あるいはE.coli生菌投与によるエンドトキシンショックが回避された。3).CD14系の機能と制御の解析:1.リコンビナントmCD14(rmCD14)およびトランスフェクト細胞作成と利用:N71を発現するE.coliおよびCHO-K1細胞を作成した。CHO-K1のN313 rmCD14はin vitroにおけるLPS刺激Mφ細胞株からのTNF-α遊離をdose-dependentに阻止した。functionalな抗体を得るために、E.coli由来のN71に対するウサギ抗体(pAb)を作成した。この抗体はマウスCD14全長tfCHO-K1細胞へのFITC標識LPSの結合を阻止した。また、LPSによるMφ細胞株からのTNF-αの産生を阻止した。また、上記のmCD14全長tfCHO-K1細胞をハムスターに免疫し、数系統のmAb産生細胞を得た。pAbではin vitroにおけるLPS刺激Mφ細胞株からのTNF-α遊離を阻止することを観察した。

1) Isolation of rCD14 cDNA and characterization of primary structure: rCD14 cDNA isolation. 2. Expression of rCD14 and physiologically active factors:Kupffer cells (KC) express the expression of CD14 and CK in MPS cells and LPS cells, and CD14 cells express the expression of CD14 and CK in LPS cells. 2). CD14 gene operation: LPS reactivity analysis:1. Analysis:1: Membrane type: non-membrane type mCD14 TM: membrane type: non-membrane type mCD14 TM: membrane type: M14M: M14S. M14M and M14S were tested for TNF-α and IL-6 in the blood after LPS(20μg/mouse) stimulation. CD14 is an anti-LPS agent. (2) The N-terminal portion of mCD14 contains 71 amino acids. The N-terminal portion of mCD14 contains 71 amino acids. The N-terminal portion of mCD14 contains 71 amino acids. The N-terminal portion of mCD14 contains 71 amino acids. LPS and E.coli strains are avoided. 3). Analysis of CD14 function and control:1. Production of CD14 (rmCD14) cells using E.coli and CHO-K1 cells. CHO-K1 and N313 rmCD14 were inhibited by dose-dependent inhibition of TNF-α release from LPS stimulated Mφ cell lines. functional antibody (pAb) was prepared from N71. The antibody blocks the binding of FITC labeled LPS to CD14 full-length tfCHO-K1 cells. TNF-α production was prevented in Mφ cell lines infected with LPS. The mCD14 full-length tfCHO-K1 cells were identified as mAb producing cells in the immune system. pAb was found to inhibit TNF-α release from LPS stimulated Mφ cell lines in vitro.

项目成果

M.Kataoka: "Leukocyte Typing VI.White Cell Differentiation Antigens" Oxford Univ.Press(in press),

M.Kataoka：“白细胞分型 VI.白细胞分化抗原”牛津大学出版社（正在印刷中），

S.Yammoto: "Bacterial Endotoxin Vol.IV Recognition and Effector Mechanism" Weiley-Liss(in press),

S.Yammoto：“细菌内毒素 Vol.IV 识别和效应机制”Weiley-Liss（出版中），

A.Haziot: "Resistance to endotoxin shock and reduced dissemination of Gram-negative bacteria in CD14-deficient mice." Immunity. 4. 407-414 (1996)

A.Haziot：“CD14 缺陷小鼠对内毒素休克的抵抗力和革兰氏阴性菌传播的减少。”

山本俊輔: "マクロファージ細胞表面上の分化抗原とその意義" 臨床免疫. 28・1. 37-48 (1996)

山本俊辅：“巨噬细胞表面的分化抗原及其意义”《临床免疫学》28・1（1996）。

N.Takai: "Primary structure of rat CD14 and characteristics of rat CD14,cytokine and NO synthase mRNA in mononuclear phagocyte system cells to LPS" J.Leuko.Biol.(in press.).

N.Takai：“大鼠 CD14 的一级结构以及单核吞噬细胞系统细胞中大鼠 CD14、细胞因子和 NO 合酶 mRNA 对 LPS 的特征”J.Leuko.Biol.（出版中）。