病原体産物に対する生体反応の中枢分子CD14の機能と機能解析に関する研究

1)1.ラットCD14(rCD14)cDNAの分離と一次構造の特徴:rCD14cDNAを分離した。2.rCD14および生理活性因子発現のカイネティクス検索:Kupffer細胞(KC)は他のMPS細胞とは異なるCD14およびCKの発現を示すこと、LPSによるCD14系のトリガーは少数の膜CD14により引かれること、upregulateされたCD14はLPSの清掃分子として機能すること、KCのTNF-α以外の生理活性因子遊離機能は乏しくLPSの清掃細胞として機能することなどが示唆された。2).CD14遺伝子操作マウスにおけるLPS反応性解析:1.トランスジェニックマウス(TM)の解析:1:膜型および非膜型mCD14TM:膜型および非膜型mCD14TMを作出した(M14MおよびM14S)。M14MおよびM14SではLPS(20μg/mouse)刺激後の血中TNF-αおよびIL-6レベルが有意に低値を示すこと、LPSによる致死性Shwartzman反応が有意に阻止されることなどを観察した。異所性CD14がLPS傷害に防御的に働くことやsoluble CD14にES阻止および促進の両面作用があることが示唆された。(2)mCD14N末端部アミノ酸71個をコードするTMの作出:mCD14のN末端71個のアミノ酸(N71)をコードするTMを肝に特異的に発現するTM(AT-N71)を作出した・2.mCD14ノックアウト(KO)マウスの解析:KOマウスではLPS刺激による末梢血単球からのCK産生は全く見られない。LPS投与あるいはE.coli生菌投与によるエンドトキシンショックが回避された。3).CD14系の機能と制御の解析:1.リコンビナントmCD14(rmCD14)およびトランスフェクト細胞作成と利用:N71を発現するE.coliおよびCHO-K1細胞を作成した。CHO-K1のN313 rmCD14はin vitroにおけるLPS刺激Mφ細胞株からのTNF-α遊離をdose-dependentに阻止した。functionalな抗体を得るために、E.coli由来のN71に対するウサギ抗体(pAb)を作成した。この抗体はマウスCD14全長tfCHO-K1細胞へのFITC標識LPSの結合を阻止した。また、LPSによるMφ細胞株からのTNF-αの産生を阻止した。また、上記のmCD14全長tfCHO-K1細胞をハムスターに免疫し、数系統のmAb産生細胞を得た。pAbではin vitroにおけるLPS刺激Mφ細胞株からのTNF-α遊離を阻止することを観察した。

1)1.ラットCD14(rCD14)cDNAの分離と一次構造の特徴:rCD14cDNAを分離した。2.rCD14および生理活性因子発現のカイネティクス検索:Kupffer細胞(KC)は他のMPS細胞とは異なるCD14およびCKの発現を示すこと、LPSによるCD14系のトリガーは少数の膜CD14により引かれること、upregulateされたCD14はLPSの清掃分子として機能すること、KCのTNF-α以外の生理活性因子遊離機能は乏しくLPSの清掃細胞として機能することなどが示唆された。2).CD14遺伝子操作マウスにおけるLPS反応性解析:1.トランスジェニックマウス(TM)の解析:1:膜型および非膜型mCD14TM:膜型および非膜型mCD14TMを作出した(M14MおよびM14S)。M14MおよびM14SではLPS(20μg/mouse)刺激後の血中TNF-αおよびIL-6レベルが有意に低値を示すこと、LPSによる致死性Shwartzman反応が有意に阻止されることなどを観察した。異所性CD14がLPS傷害に防御的に働くことやsoluble CD14にES阻止および促進の両面作用があることが示唆された。(2)mCD14N末端部アミノ酸71個をコードするTMの作出:mCD14のN末端71個のアミノ酸(N71)をコードするTMを肝に特異的に発現するTM(AT-N71)を作出した・2.mCD14ノックアウト(KO)マウスの解析:KOマウスではLPS刺激による末梢血単球からのCK産生は全く見られない。LPS投与あるいはE.coli生菌投与によるエンドトキシンショックが回避された。3).CD14系の機能と制御の解析:1.リコンビナントmCD14(rmCD14)およびトランスフェクト細胞作成と利用:N71を発現するE.coliおよびCHO-K1細胞を作成した。CHO-K1のN313 rmCD14はin vitroにおけるLPS刺激Mφ細胞株からのTNF-α遊離をdose-dependentに阻止した。functionalな抗体を得るために、E.coli由来のN71に対するウサギ抗体(pAb)を作成した。この抗体はマウスCD14全長tfCHO-K1細胞へのFITC標識LPSの結合を阻止した。また、LPSによるMφ細胞株からのTNF-αの産生を阻止した。また、上記のmCD14全長tfCHO-K1細胞をハムスターに免疫し、数系統のmAb産生細胞を得た。pAbではin vitroにおけるLPS刺激Mφ細胞株からのTNF-α遊離を阻止することを観察した。