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MutSヘテロダイマーによるミスマッチ認識機構の解析

MutS异二聚体错配识别机制分析

基本信息

批准号：
12143206
负责人：
池島三与子
金额：
$ 16万
依托单位：
Nippon Medical School
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2004
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-12143206/
关键词：
ミスマッチ修復 DNA修復蛋白質遺伝子治療ゲノム不安定性発癌

项目摘要

ミスマッチを持つオリゴヌクレオチドを用いた遺伝子修復においてMutSヘテロダイマーによるミスマッチ認識機構を解析する。また遺伝子修復におけるミスマッチ修復(MMR)系および他の修復系の関与を明らかにする。ミスマッチ修復系の認識機構を明らかにするだけでなく遺伝子を改変する技術としての開発も目標とする。1)無細胞遺伝子修復系の確立とミスマッチ修復の関与:変異したlacZalpha遺伝子をcodeするplasmidを、オリゴヌクレオチドおよび細胞抽出液とin vitroでインキュベートし、回収したplasmidのファージの色を解析した。すると、低い頻度(0.09%)ながら変異塩基の正常塩基への修復を見出した。表現型による遺伝子修復アッセイは煩雑で時間がかかるためDNAを用いたアッセイを検討したが、表現型アッセイを上回る方法は開発できなかった。MMRの関与を調べるために、MMRが正常なHL60細胞の代わりに、hMSH2を欠損しているLoVo細胞、あるいはhMLH1が欠損しているHCT116細胞の抽出液を使用したところ修復効率が上昇し、MMRが遺伝子修復に関与していないことを示唆した。2)細胞を用いた遺伝子修復系の確立とミスマッチ修復の関与:不活化したneomycin^r遺伝子を標的遺伝子としてstableに発現するHeLa細胞を樹立した。1.5 x 10^5 cellにオリゴヌクレオチドをtransfectしたがneomycin^r細胞は得られなかった。一方、同様の実験をMMRが正常なHeLa細胞の代わりに、MMRが異常なHCT116細胞のStable transformantにおいて行うと、neomycin^r細胞が得られ、塩基配列を調べた結果、標的塩基部位で正常塩基への置換が起こっていることがわかった。3)標的DNAの断片とミスマッチを持つ単鎖オリゴヌクレオチドとの複合体とhMutSalphaの結合:標的DNAの断片とミスマッチを持つ単鎖オリゴヌクレオチドとの複合体に精製したhMutSalphaを加えるとミスマッチ依存性を持つゲルシフトを示すことから、D-loop中のミスマッチはhMutSalphaにより認識されると考えられた。しかし、無細胞および細胞の修復アッセイの結果からMMRは遺伝子修復が起こらないように働いていることが示唆された。

ミスマッチを持つオリゴヌクレオチドを用いた遗伝子修复においてMutSヘテロダイマーによるミスマッチ认识机构を解析する。The relationship between MMR and other repair systems is discussed. The understanding of the restoration system is clear. 1)The establishment of cell-free gene repair system is related to the analysis of plasmid code, plasmid code and cell extract in vitro. The repair of abnormal and normal basal cells was observed at low frequency (0.09%). Phenotypic DNA repair is a new method of DNA repair. MMR is related to the regulation of HL60 cells, HMSH2 cells, HMLH1 cells, HCT116 cells, HMSH2 cells and HCT116 cells. 2)Establishment of a repair system for HeLa cells using neomycin as a target gene and its stability 1.5 x 10^5 cell is a cell that can be used to detect the presence of neomycin. One side, the same type of MMR is normal HeLa cell generation, MMR is abnormal HCT116 cell Stable transformer, neomycin^r cell is obtained, base alignment is adjusted, target base site is normal base replacement is initiated. 3)The target DNA fragment is isolated from the target DNA fragment, and the target DNA fragment is isolated from the target DNA fragment. The target DNA fragment is isolated from the target DNA fragment. The results of cell-free and cell-free repair are as follows: MMR, repair, repair, repair.