ヒトMSH3蛋白質の機能解析

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私達は、バキュロウイルス系による発現蛋白質を用いてヒトのMutSホモログの一つであるhMSH3がミスマッチ修復の初期過程であるミスマッチ結合に直接関与することをすでに明かにした。すなわちhMSH3をhMSH2と共に発現させると hMutSβ(hMSH2/hMSH3)を形成し、2-4塩基の挿入/欠失ミスペアに結合した。hMutSβの活性は、hMSH2を含むもう一つの複合体、hMutSα(hMSH2/hMSH6)が塩基置換ミスマッチおよび1塩基の挿入/欠失ミスペアに結合するのと質的に相補していた。本年度は細胞の核抽出液を用いたミスマッチ結合活性を測定する方法を確立した。ミスマッチ結合活性はgel shift assayとwestern assayを組み合わせたShift-Western法で測定し、hMutSαあるいはhMutSβとミスマッチとの複合体を同定した。hMSH3蛋白質に対する抗体を作成し核抽出液に添加しミスマッチ修復活性への阻害様式を検討した。塩基置換ミスマッチの修復活性は阻害されず、2塩基の挿入/欠失ミスペアとの活性のみが阻害され、発現蛋白質を用いて得られた結合実験の基質特異性の結果と一致した。以上のことからhMSH3蛋白質は細胞内において挿入/欠失ミスペアの認識および修復に直接関与すると考えられ、その変異は細胞のミスマッチ修復活性を低下させゲノム不安定性に重大な影響をもたらすと考えられた。一方hMSH3遺伝子が増幅しているメソトレキセート耐性細胞ではhMutSαの形成が抑制され、塩基置換ミスマッチ修復活性が低下し、ゲノム不安定性が昂進していた。このことはhMSH3遺伝子の変異だけでなく発現量の極端な変動も細胞のミスマッチ修復およびゲノム安定性の維持に重要な影響を与えることを示している。