水晶発振子を用いる分子シンクロナイゼーションの定量的評価

使用晶体振荡器定量评估分子同步

• 批准号: 13022223
• 负责人: 岡畑 恵雄
• 金额: $ 2.69万
• 依托单位: Tokyo Institute of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-13022223/
• 关键词: DNAポリメラーゼ; 水晶発振子; DNA固定化発振子; 4穴式水晶発振子; 酸素反応機構; DNA鎖の伸長; ポリメラーゼ; ミカエリス-メンテン式

水晶発振子マイクロバランス法を用いて生体中でおこる微細な各反応を質量変化としてとらえ、シンクロナイズされた全反応を定量的に評価することを目的として以下の研究成果をあげた。1)27MHz水晶発振子の金電極表面にビオチン-アビジン法を用いてプライマー/テンプレート部をもつDNA鎖を固定化し、水溶液中にポリメラーゼ(大腸菌由来のklenow fragment)とモノマー(dGTP or dATP)を加え、DNAのポリメラーゼ反応を振動数(重量)変化として追跡する事に成功した。2)各素過程はシンクロナイズされて進行するので、酵素のDNA鎖への結合過程(Ka/M-1),テンプレート鎖に沿った重合過程(km.kcat)および重合したDNA鎖からの脱離過程(Kd/M-1)の動力学定数を求めることができた。3)プライマーやテンプレート部分のDNAの塩基配列を変えたときの酵素の結合速度や重合速度、あるいは酵素の脱離速度について検討し、酵素重合速度がテンプレート鎖長に依存することがわかった。4)酵素がテンプレート部分をすべりながら重合していく過程を詳しく検討し、ポリメラーゼが最初にテンプレートに結合し、DNA鎖上を滑りながら重合していくことが明らかにできた。

発 crystal oscillator マ イ ク ロ バ ラ ン を ス method with い て in living body で お こ る imperceptible な each reverse 応 を quality variations change と し て と ら え, シ ン ク ロ ナ イ ズ さ れ た against all 応 を に of quantitative evaluation of 価 す る こ と を purpose と し て の under research を あ げ た. 1) 27 MHZ 発 crystal oscillator の gold electrode surface に ビ オ チ ン - ア ビ ジ を ン method with い て プ ラ イ マ ー / テ ン プ レ ー ト department を も つ DNA lock を immobilized し, in aqueous solution, に ポ リ メ ラ ー ゼ (coliform origin の klenow fragment) と モ ノ マ ー (dGTP or DATP) を え, DNA の ポ リ メ ラ ー ゼ anti 応 を vibration number (weight) - と し て tracing す る matter に success し た. 2) each element process は シ ン ク ロ ナ イ ズ さ れ て in す る の で, enzyme の DNA lock へ の process (Ka/M - 1), テ ン プ レ ー ト lock に along っ た overlap process (km) kcat) お よ び overlap し た DNA lock か ら の from process (Kd/M - 1) の dynamics destiny を o め る こ と が で き た. 3) プ ラ イ マ ー や テ ン プ レ ー ト part の DNA の salt base with column を - え た と き の enzyme の combining speed や overlap, あ る い の は enzyme from speed に つ い て beg し 検 coincidence rate, enzyme が テ ン プ レ ー ト lock long に dependent す る こ と が わ か っ た. 4) enzyme が テ ン プ レ ー ト part を す べ り な が ら overlap し て い を く process detailed し く beg し, 検 ポ リ メ ラ ー ゼ が initially に テ ン プ レ ー ト に combining し, DNA lock を slide り な が ら overlap し て い く こ と が Ming ら か に で き た.

项目成果

H.Furusawa, Y.Kitamura, N.Hagiwara, T.Turimoto, Y.Okahata: "Binding Kinetics of the Toroidal-Shaped PCNA to DNA Strands on a 27 MHz Quartz-Crystal Microbalance"ChemPhysChem.. No.5. 446-448 (2002)

H.Furusawa、Y.Kitamura、N.Hagiwara、T.Turimoto、Y.Okahata：“27 MHz 石英晶体微天平上环形 PCNA 与 DNA 链的结合动力学”ChemPhysChem.. No.5。

M.Naito, Y.Sasaki, T.Dewa, Y.Aoyama, Y.Okahata: "Effect of Solvation on Induce-fit Molecular Recognition in Supercritical Fluid to Organic Crystals immobilized on a Quartz Crystal microbalance"J. Am. Chem. Soc.. 123. 11037-11041 (2001)

M.Naito，Y.Sasaki，T.Dewa，Y.Aoyama，Y.Okahata：“溶剂化对超临界流体中对固定在石英晶体微天平上的有机晶体的诱导拟合分子识别的影响”J。

H.Matsuno, Y.Okahata: "Direct Monitoring of DNA Cleavages catalyzed by an ATP-dependent Deoxyribonuclease on a 27 MHz Quartz-Crystal Microbalance"Chem.Commun. 470-471 (2002)

H.Matsuno、Y.Okahata：“在 27 MHz 石英晶体微天平上直接监测 ATP 依赖性脱氧核糖核酸酶催化的 DNA 裂解”Chem.Commun。

H.Matsuno, K.Niikura, Y.Okahata: "Direct Monitoring and Kinetic Studies of DNA Polymerase Reactions on a DNA-immobilized Quartz-Crystal Microbalance"Chem. Eur. J.. 7. 3305-3312 (2001)

H.Matsuno、K.Niikura、Y.Okahata：“DNA 固定石英晶体微天平上 DNA 聚合酶反应的直接监测和动力学研究”Chem。

H.Matsuno, H.Furusawa, Y.Okahata: "Kinetic analyses of ATP-dependent deoxiribonuclease (DNase) reactions on a quartz-crystal microbalance"Nucleic Acids Res. Suppl.. 1. 261-262 (2001)

H.Matsuno、H.Furusawa、Y.Okahata：“石英晶体微天平上 ATP 依赖性脱氧核糖核酸酶 (DNase) 反应的动力学分析”核酸研究。