細胞膜や核膜を介したDNAの能動輸送システムの開発

开发 DNA 穿过细胞膜和核膜的主动运输系统

• 批准号: 13022240
• 负责人: 湯通堂 満寿男
• 金额: $ 2.3万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-13022240/
• 关键词: 核移行シグナル; 核膜孔; ラムダファージ; importin; DNA; 高分子ポリマー; マイクロインジェクション; 細胞内輸送; 核移行; ファージ; in vitro system; 能動輸送

我々は、高分子ポリマー・DNA複合体(Polyplex)のモデルとして粒子表面にさまざまなペプチドを呈示できる組換えラムダファージ(直径55nm)を選び、SV40のT抗原由来の32merの核移行シグナル(SVLT32)を表面に発現しているファージ粒子が核膜孔を介して核内に輸送される現象を見いだした(Akuta, et al.2002)。本年度は、この成果を基に、ファージ粒子のような巨大分子を核に輸送するために必要な核移行シグナルの構造を解析した。具体的には、さまざまな変異核移行シグナルを作成し、それぞれを表面に発現させたファージ粒子を精製して、マイクロインジェクション後の細胞内の挙動とimportin alphaとの結合活性を調べた。細胞内の挙動は核分画から回収されるファージ粒子の数(大腸菌への感染価)を指標に用いた。また大腸菌で作った組換えimportin alphaを使った沈降アッセイにより結合を測定した。その結果、組換えファージが核に輸送される活性はimportinとの結合活性と完全に一致すること、またSVLT32のminimum NLS以外の部分をすべて他のアミノ酸と置き換えても核への輸送活性は保たれることが明らかになった。さらに、importinがminimum NLSと結合するためにはminimum NLSからC末端側のアミノ酸が13残基あることが必要であることがわかり、C末端側はファージ粒子の表面とminimum NLSの間の支柱(stem)の役割を果たしていることが明らかになった。またN末端をさまざまなTag配列で置き換えた変異体の中にはimportinとの結合活性を失っているものがあった。このことから、N末端の配列はimportinとminimum NLSの結合を妨げない構造であることが重要であると考えられた。

I 々 は, polymer ポ リ マ ー · DNA complexes (Polyplex) の モ デ ル と し て particle surface に さ ま ざ ま な ペ プ チ ド を presented で き る group in え ラ ム ダ フ ァ ー ジ (55 nm in diameter) を び, SV40 の T antigen origin の 32 killing の nuclear migration シ グ ナ ル (SVLT32) を surface に 発 now し て い る フ ァ ー ジ particle が nuclear pore を interface し て in nuclei に conveying さ れ る phenomenon を see い だ し た (Akuta, et al. 2002). This year は, こ の results を に, フ ァ ー ジ particle の よ う な giant molecular を nuclear に conveying す る た め に necessary な nuclear migration シ グ ナ ル の tectonic analytical し を た. Specific に は, さ ま ざ ま な - heteronuclear transition シ グ ナ ル を し, consummate そ れ ぞ れ を surface に 発 now さ せ た フ ァ ー ジ particle を refined し て, マ イ ク ロ イ ン ジ ェ ク シ ョ ン の cells after の 挙 dynamic と importin alpha と の binding activity を adjustable べ た. Intracellular の 挙 dynamic は nuclear points draw か ら back 収 さ れ る フ ァ ー の ジ particle number (coliform へ の infection 価) を index に with い た. ま た coliform で as っ た group in え importin alpha を make っ た sink ア ッ セ イ に よ り し combination with the determination of the を た. そ の result, group change え フ ァ ー ジ が nuclear に conveying さ れ る active は importin と の combining activity was completely consistent に す と る こ と, ま た SVLT32 の minimum NLS の the partial を す べ て he の ア ミ と buy き ノ acid in え て も nuclear へ の conveying active は bartender た れ る こ と が Ming ら か に な っ た. さ ら に, importin が minimum NLS と combining す る た め に は minimum NLS か ら C terminal side の ア ミ が 13 ノ acid residues あ る こ と が necessary で あ る こ と が わ か り, C terminal side は フ ァ ー の ジ particle surface と minimum The stem (stem) of the NLS is used to harvest を fruit た <s:1> て る る とが とが light ら る になった. ま た N terminal を さ ま ざ ま な Tag with column で buy き in え た variations in allograft の に は importin と の binding activity を lost っ て い る も の が あ っ た. こ の こ と か ら, N terminal の match column は importin と minimum NLS の combining を hinder げ な い tectonic で あ る こ と が important で あ る と exam え ら れ た.

项目成果

Yoshioka, N., et al.: "Suppression of anchorage-independent growth of human cancer cell lines by the TRIF52/Periostin/OSF-2 gene"Exp.Cell Res.. 279. 91-99 (2002)

Yoshioka, N., et al.：“TRIF52/Periostin/OSF-2 基因抑制人类癌细胞系的锚定非依赖性生长”Exp.Cell Res. 279. 91-99 (2002)

Watari, A., et al.: "Multi-functional gene ASY/Nogo/RTN-X/RTN4 : Apoptosis, tumor suppression. and inhibition of neronal regeneration"Apoptosis. 8. 5-9 (2003)

Watari, A.等人：“多功能基因ASY/Nogo/RTN-X/RTN4：细胞凋亡、肿瘤抑制和神经元再生抑制”细胞凋亡。

M.Shimakage, 他: "Expression of Epstein-Barr virus in cutaneous T-cell lymphoma including mycosis fungoides"International Journal of Cancer. 92. 226-231 (2001)

M.Shimakage 等人：“Epstein-Barr 病毒在皮肤 T 细胞淋巴瘤中的表达，包括蕈样肉芽肿”，国际癌症杂志 92. 226-231 (2001)。

Akuta, T., et al.: "Enhancement of Phage-Mediated Gene Transfer by Nuclear Localization Signal"Biochem.Biophys.Res.Commun.. 297. 772-779 (2002)

Akuta，T.等人：“通过核定位信号增强噬菌体介导的基因转移”Biochem.Biophys.Res.Commun. 297. 772-779 (2002)

Shirai, F., et al.: "Human peripheral blood polymorphonuclear leukocytes at the ovulatory period are in an activated state"Mol.Cell.Endocrinol.. 196. 21-28 (2002)

Shirai, F., et al.：“排卵期的人外周血多形核白细胞处于激活状态”Mol.Cell.Endocrinol.. 196. 21-28 (2002)