異物、薬物排出ポンプ蛋白の結晶解析と機能

外来物质和药物外排泵蛋白的晶体分析和功能

• 批准号: 13033038
• 负责人: 中江 太治
• 金额: $ 2.05万
• 依托单位: Tokai University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-13033038/
• 关键词: 膜蛋白; 結晶; X線解析; 膜輸送; 排出; 異物; 抗生物質; 薬剤耐性; 外膜蛋白; 構造解析; 排出ポンプ; 院内感染

病院内感染起因菌の一つである緑膿菌は、構造的にまた作用機作の上からも異なる多くの抗生物質に耐性を示す。この低特異的抗生物質耐性の主たる原因は、この菌がMexAB-OprM異物・抗生物質排出ポンプを発現することに原因している。本研究ではこの異物・抗生物質排出ポンプの作動を明らかとするためポンプサブユニットの結晶回析及び作動機序の研究を行った。ポンプサブユニットの結晶解析に関しては、MexA及びOprMの結晶を取扱った。(i)MexAは元来内膜に結合した膜蛋白であるが、膜結合部位であるN-末の脂肪酸を外したものの結晶化を行った。結晶はPhoton Factory放射光でOscillation angle 1度、カメラ長350mm、100k、distance 350mmでデータ収集を行った。その結果スペースグループP21、格子常数a=90 b=107 c=90Å、解像度3.5Åを得ている。現在のところ重金属置換体を作成中であり、Pt、Os、Sm、Cd、Trなどで安定的なデータが得られており解像度約3.5が恒常的に得られている。(ii)OprMは界面活性剤の存在下に結晶化をすすめており、得られている結果はrhombohedral型R32空間群に属しており、格子常数はa=b=85.24Å、c=1044.96Åである。放射光施設Spring8でのカメラ長350mm、Oscillation angle 1度、温度100k、波長0.9Åでの回析では約2.6Åの解像度を得ている。現在のところ位相を決定すべくHg、Pt及びTh置換体を調整して回析を行っているが、未だ位相の決定には到っていない。この結晶は格子常数c値が高いことから解析の困難さが予想されるが、遠からず構造が解けるものと考えられる。(iii)その他排出ポンプの作動機序の解明のため(a)MexBサブユニットのTMS-4と-10の相互作用の実験、(b)MexEF-OprNポンプの集合体形成及びbiogenesisの実験及び、(c)排出ポンプとDNA-gyrase共役によるキノロン剤高度耐性の機序の解析などを行い各々に成果を得た。

Disease cause nosocomial infection bacterium の つ で あ る pseudomonas bacteria は, constructed に ま た effect on machine for の か ら も different な る more く の antibiotic substances に patience を す. こ の low specific antibiotic substances patience の main た る は, こ の bacteria が MexAB - OprM eyewinker, antibiotic substances out ポ ン プ を 発 now す る こ と に reason し て い る. This study で は こ の eyewinker, antibiotic substances out ポ ン プ の actuation を Ming ら か と す る た め ポ ン プ サ ブ ユ ニ ッ ト の crystallization of back analysis, as well as motivation sequence の を び line っ た. Youdaoplaceholder0, プサブユニット, プサブユニット, <s:1> crystallization analysis に related to <s:1> て,, MexA and びOprM <s:1> crystals を take the った. (I) MexA は yuan to lining に combining し た membrane protein で あ る が, membrane combining site で あ る の fatty acids at the end of the N - outside を し た も の の crystallization を line っ た. The crystal で Photon Factory emits light でOscillation angle 1 degree, カメラ length 350mm, 100k, distance 350mmでデ で タ タ collects を rows った. そ の results ス ペ ー ス グ ル ー プ P21, lattice constant a = b = 90 107 c = 3.5 a, 90 a, of the resolution を must て い る. Now の と こ ろ を heavy metal replacement body made of で あ り, Pt, Os, Sm, Cd, Tr な ど で stable な デ ー タ が have ら れ て お り resolutions about 3.5 が constant に must ら れ て い る. (ii) OprM は に crystallized in the presence of interfacial active tonic の を す す め て お り, ら れ て い る results は rhombohedral type R32 space group に genus し て お り, lattice constant は a = b = 85.24 a, c = 1044.96 a で あ る. When Spring8で カメラ カメラ is set up with a length of 350mm, an Oscillation angle of 1 degree, a temperature of 100k, and a wavelength of 0.9A, で <s:1> hysteresis で で approximately 2.6A <s:1> resolution を is obtained. The て る る る is obtained. Now の と こ ろ phase を decided す べ く Hg, Pt and び Th replacement body を adjustment し を line っ て back to analyse て い る が, not だ phase の decision に は to っ て い な い. こ の high crystallization は lattice constant c numerical が い こ と か ら parsing の difficult さ が to think さ れ る が, far か ら ず tectonic が solution け る も の と exam え ら れ る. (iii) そ の he discharge ポ ン プ の as motivation sequence の interpret の た め (a) MexB サ ブ ユ ニ ッ ト の と TMS - 4-10 の interaction の be 験, (b) MexEF - OprN ポ ン プ の aggregate formation and び biogenesis の be 験 and び, (c) discharge ポ ン プ と に DNA gyrase - a total service よ る Youdaoplaceholder0 <s:1> the sequence of the highly tolerant test <s:1> is analyzed. Youdaoplaceholder1 <s:1> を を rows を each 々に result を gives た.

项目成果

Guan, L.: "Identification of essential charged residues in transmembrane segments of the multidrug transporter MexB of Pseudomonas aeruginosa"Journal of Bacteriology. 183. 1734-1739 (2001)

管，L.：“铜绿假单胞菌多药转运蛋白 MexB 跨膜片段中必需带电残基的鉴定”细菌学杂志。

Hroshi Yoneyama: "Second-site mutation restores the transport defect caused by the transmembrane domain mutation of the xenobiotic transporter MexB in Pseudomonas aeruginosa"Biochemical and Biophysical Research Communications. 292. 513-518 (2002)

Hroshi Yoneyama：“第二位点突变恢复了铜绿假单胞菌中异生物质转运蛋白 MexB 跨膜结构域突变引起的转运缺陷”《生物化学和生物物理研究通讯》。

Taiji Nakae: "The topological localization of the subunit proteins of the three-component RND-efflux pump, MexAB-OprM in Pseudomonas aeruginosa"Proceedings of SPIE. 4625. 106-117 (2002)

Taiji Nakae：“铜绿假单胞菌中三组分 RND 外排泵 MexAB-OprM 亚基蛋白的拓扑定位”SPIE 论文集。

Saito, K.: "Molecular mechanism of MexR-mediated regulation of MexAB-OprM efflux expression in Pseudomonas aeruginosa"FEMS Microbiology Letters. 195. 23-28 (2001)

Saito, K.：“铜绿假单胞菌中 MexR 介导的 MexAB-OprM 外排表达调节的分子机制”FEMS 微生物学快报。

Shima Eda: "An elegant means of self-protection in gram-negative bacteria by recognizing and extruding xenobiotics from the periplasmic space"Journal of Biological Chemistry. 278. 2085-2088 (2003)

Shima Eda：“通过识别并从周质空间中挤出异生物质，是革兰氏阴性细菌自我保护的一种优雅方法”《生物化学杂志》。