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X線解析を目指した多剤耐性ポンプMDR1の大量発現系の構築と結晶化

用于X射线分析的多药耐药泵MDR1大规模表达系统的构建和结晶

基本信息

批准号：
16659012
负责人：
加藤博章
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

ヒトの多剤耐性ポンプMDR1を対象として、X線結晶構造解析を目的とした結晶化を達成することを目的として以下の研究を行なった。1.X線結晶解析に適したMDRl結晶の調製結晶化条件探索を広範囲に拡大するため、更なる大量生産系を構築した。すなわち、30リットル/1ヶ月の培養ペースで連続して安定な生産が可能になった。さらに、精製蛋白質の質的改善を目指し、構造安定性の向上に寄与する界面活性剤を検索した。約20種類の界面活性剤を検討した結果、1つの界面活性剤が新たに見つかった。一方、結晶化能を向上させると予想される2種類の部位特異的変異導入蛋白質を大量発現、精製することに成功した。得られた精製標品を用いて結晶化を行なったところ、微針状結晶からキューブ状の微結晶が得られた。しかし、X線を照射してもX線回折像は得られなかった。さらに改良を検討している。2.Fab複合体調製による結晶化の支援MDR1の細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体を入手して検索した結果、立体構造特異的な結合をしていると示唆されるFab断片を得ることができた。そして、MDR1との複合体を形成していることがゲル濾過から示された。3.膜蛋白質の結晶化能を把握する手法の確立可溶性蛋白質では、精製した蛋白質溶液の動的光散乱分析により分子量分布の狭い試料は結晶化の可能性が高いことが知られている。そこで、膜タンパク質における同様の方法を検討した。その結果、電子顕微鏡を用いた蛋白質分子の直接観察およびゲル濾過法の利用により、界面活性剤の存在下でも分子量分布の広狭の違いを観測することが可能になった。

ヒトの多剤resistant ポンプMDR1 を対image として, X-ray crystal structure analysis をobjective としたcrystallization をachieved することをpurpose として following のresearch を行なった. 1. X-ray crystallization analysis is used to explore the modulation crystallization conditions of MDRl crystal and to build a mass production system.すなわち, 30リットル/1ヶ月の文化ペースで连続して stabilized productionがpossibleになった.さらに, improvement of the quality of purified protein, improvement of structural stability, and improvement of interface activity. Approximately 20 types of interface active materials are produced, and 1 new interface active materials are produced. On the one hand, the crystallization energy has been improved, and the two types of part-specific mutations introduced into the protein have been successfully demonstrated and refined in large quantities. The refined standard product of られた is obtained by using いて crystallization を行なったところ and micro-needle crystals からキューブ-shaped micro-crystals られた.しかし, X-ray irradiation, してもX-ray reflection image, られなかった.さらに Improved を検している. 2.Fab complex preparation and crystallization to support MDR1 extracellular DNA testing The results of the hand-made and three-dimensional structure-specific combination of the three-dimensional structure and the specific three-dimensional structure of the Fab fragment are obtained.そして, MDR1 との complex を formed していることがゲル filtered からshows された. 3. How to grasp the crystallization ability of membrane proteins and how to establish soluble proteins and refine protein solutions Dynamic light scattering analysis can narrow the molecular weight distribution of the sample and improve the possibility of crystallization.そこで, film タンパク性における同様のmethod を検した. As a result, the direct observation of protein molecules using electron microscopy and the use of filtration method were used. , In the presence of interface active agents, the molecular weight distribution of the molecular weight distribution is narrow and the measurement is possible.

项目成果

期刊论文数量（16）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Crystal structure of a myristoylated CAP-23/NAP-22 N-terminal domain complexed with Ca2+/calmodulin

DOI：
10.1038/sj.emboj.7600093
发表时间：
2004-02-25
期刊：
EMBO JOURNAL
影响因子：
11.4
作者：
Matsubara, M;Nakatsu, T;Taniguchi, H
通讯作者：
Taniguchi, H

Role of Pex19p in the targeting of PMP70 to peroxisome

DOI：
10.1016/j.bbamcr.2005.10.006
发表时间：
2005-12-15
期刊：
BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA-MOLECULAR CELL RESEARCH
影响因子：
5.1
作者：
Kashiwayama, Y;Asahina, K;Imanaka, T
通讯作者：
Imanaka, T

Crystal structures of pyruvate phosphate dikinase from maize revealed an alternative conformation in the swiveling-domain motion.

DOI：
10.1021/bi0484522
发表时间：
2005-02
期刊：
Biochemistry
影响因子：
2.9
作者：
T. Nakanishi;T. Nakatsu;M. Matsuoka;K. Sakata;H. Kato
通讯作者：
T. Nakanishi;T. Nakatsu;M. Matsuoka;K. Sakata;H. Kato

Crystal structure of the PsbP protein of photosystem II from Nicotiana tabacum

DOI：
10.1038/sj.embor.7400113
发表时间：
2004-04-01
期刊：
EMBO REPORTS
影响因子：
7.7
作者：
Ifuku, K;Nakatsu, T;Sato, F
通讯作者：
Sato, F

Crystal structure of the C-terminal clock-oscillator domain of the cyanobacterial KaiA protein

DOI：
10.1038/nsmb781
发表时间：
2004-07-01
期刊：
NATURE STRUCTURAL & MOLECULAR BIOLOGY
影响因子：
16.8
作者：
Uzumaki, T;Fujita, M;Ishiura, M
通讯作者：
Ishiura, M

DOI：
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加藤博章其他文献

Lafitidine-induced increase in intracellular Ca2+ concentrations in PC12 and endothelial cells.

拉菲替丁诱导 PC12 和内皮细胞细胞内 Ca2+ 浓度增加。

DOI：
发表时间：
2005
期刊：
J.Pharmacol.Sci. 97
影响因子：
0
作者：
Kashiwayama;Y.;Tsugumi Nakanishi;Takao Hibi;Hiroyuki Shibata;Tatsuya Uzumaki;Kentaro Ifuku;Toru Komatsu et al.;Mamoru Matsubara;Tasuku Ueno et al.;加藤博章;Yu Gabe et al.;Kazuki Kiyose et al.;Takuya Terai et al.;Takatoshi Yogo et al.;Mako Kamiya et al.;Kensuke Komatsu et al.;Eita Sasaki et al.;Yasuteru Urano et al.;Eri Kawabata et al.;Shigeki Hattori et al.;Tasuku Ueno et al.;Kenjiro Hanaoka et al.;Daisuke Nagata et al.;Suguru Kenmoku et al.;Yu Gabe et al.;Horie et al.;Kunieda et al.;Minowa et al.;Kunieda et al.
通讯作者：
Kunieda et al.

A General Synthesis of N-Reverse-Prenyl Indoles

N-反异戊二烯吲哚的一般合成

DOI：
发表时间：
2004
期刊：
Synthesis
影响因子：
0
作者：
Kashiwayama;Y.;Tsugumi Nakanishi;Takao Hibi;Hiroyuki Shibata;Tatsuya Uzumaki;Kentaro Ifuku;Toru Komatsu et al.;Mamoru Matsubara;Tasuku Ueno et al.;加藤博章;Yu Gabe et al.;Kazuki Kiyose et al.;Takuya Terai et al.;Takatoshi Yogo et al.;Mako Kamiya et al.;Kensuke Komatsu et al.;Eita Sasaki et al.;Yasuteru Urano et al.;Eri Kawabata et al.;Shigeki Hattori et al.;Tasuku Ueno et al.;Kenjiro Hanaoka et al.;Daisuke Nagata et al.;Suguru Kenmoku et al.;Yu Gabe et al.;Horie et al.;Kunieda et al.;Minowa et al.;Kunieda et al.;Minowa et al.;K.Yoshizawa;K.Yoshizawa;K.Yoshizawa;W.I.Li;Kubota et al.;T.Shioiri;F.Yokokawa
通讯作者：
F.Yokokawa