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膜7回貫通型受容体のX線解析に向けた蛋白質発現と結晶化

七种跨膜受体的 X 射线分析的蛋白质表达和结晶

基本信息

批准号：
11878124
负责人：
佐藤能雅
金额：
$ 1.34万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

项目摘要

膜7回貫通型受容体は,アゴニストと特異的に結合して活性化し,Gタンパク質などを介して細胞内にリガンド結合の情報を伝達する糖鎖が付加された膜タンパク質である。本研究は,この膜貫通型受容体の三次元構造をX線結晶構造解析により明らかにし,その機能の薬理学的な理解を得るため,受容体の大量発現と結晶化の方法の構築を目的とした。研究では,従来はμg/(L培地)オーダーの発現量しか得られなかった受容体の発現量を,ヒトβ2アドレナリン受容体について約2mg/(L培地)程度まで飛躍的に高めることができた。受容体の全長DNAを酵母α-ファクターのシグナルの下流に連結させ,メタノール資化酵母ゲノム内に発現ベクターを組み込んだ。シグナルのペプチドが切断除去され,分子表面に糖鎖が付加した完全長の受容体を発現させた。界面活性剤により受容体を可溶化し,リガンドとの結合活性も確認した。結晶化のためには糖鎖の均一化と短鎖化が有効と考え,糖切断酵素Endoglycosidase HFを用いて効率良く短鎖化する手順も構築した。精製に用いるクロマトグラフィーカラムを検討し,精製を行った。さらに,分離精製のために,受容体と抗体の双方に結合できるリガンドを考案し,受容体と抗体を複合体として検出できる系も開発した。研究では,さらに,ヒトβ3アドレナリン受容体についても,メタノール資化酵母に遺伝子を組み込んで発現株を樹立した。グルタチオンS-トランスフェラーゼとの融合タンパク質など様々な発現体を試みたが,β3受容体に相当する発現量は得られていない。低発現量の原因を調べた結果,アミノ末端側のポリペプチド鎖領域に由来すると考えられた。構築したβ2受容体の発現系はこれまで最も高い発現量をもたらし,結晶化のための糖鎖の処理と精製の見通しも得られた。今後も結晶化の成功に向けて研究を展開する計画である。

The membrane 7-loop receptor is activated by specific binding, and the glucose chain is added to the membrane by the intracellular binding information. The purpose of this study is to understand the three-dimensional structure of the membrane-through-type receptor, to understand its function, to develop a large number of receptors and to construct crystallization methods. In this study, we found that the amount of receptor was about 2 mg/(L culture), and the amount of receptor was about 2mg/(L culture). The full-length DNA of the recipient yeast α-amino acid sequence is linked to the downstream of the yeast, and the DNA sequence is generated in the yeast. The sugar chain on the surface of the molecule is added to the complete length of the receptor. The interface activity is determined by the solubility of the receptor and the binding activity of the receptor. Crystallization and homogenization of sugar chains are possible, and sugar cutting enzyme Endosidase HF is useful in order to achieve good short-chain structure. Refined with the help of the Internet, refined. In the meantime, the separation and purification of the receptor and antibody complex are carried out. In this study, the β3-D receptor was established in the medium, and the yeast was isolated from the medium. The amount of β3 receptor corresponding to the amount of β3 receptor was found in the sample. The reason for the low emission is the result of the adjustment, and the reason for the failure of the terminal side of the lock field is the examination. The formation of β2 receptors is the highest in quantity, and the crystallization and purification of sugar chains are achieved. Future research on crystallization is planned.