細菌リポ蛋白質の膜遊離を触媒する新規ABCトランスポーターの構造

催化细菌脂蛋白膜释放的新型ABC转运蛋白的结构

基本信息

批准号：
13117201
负责人：
徳田元
金额：
$ 8.32万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

リポ蛋白質+2位のアミノ酸残基がアスパラギン酸の場合のみリポ蛋白質は内膜に残留する。内膜残留シグナルはなぜその役割を発揮するかを、LolCDEとリポ蛋白質を再構成したプロテオリポゾームで調べた。その結果、内膜残留シグナルを持つリポ蛋白質は、LolCDEの基質にならないこと、すなわちLol回避シグナルであることを明らかにした。一方、選別シグナルが遊離反応の時に機能するのか、リポ蛋白質の脂質修飾に影響を与えるのかについては、確定していなかった。そこで、アポ型リポ蛋白質を調製し、in vitroで成熟体リポ蛋白質に変換する実験系を構築し解析し、選別シグナルによって脂質修飾は異ならないこと、選別シグナルは遊離反応のみに影響を持つことを確立した。強く内膜に残留するシグナルを持ったリポ蛋白質を、外膜にまで運んでしまう変異株を分離したところ、LolCDE複合体の膜サブユニットLolCの40番目のアラニンがプロリンに変化した変異体であった。さらにこの変異体の分離によって、これまで不可能であったLolAとLolBが選別シグナルを認識するかどうかを調べた。その結果、選別シグナルは、LolCDEのみが認識することが初めて明らかになった。膜サブユニットLolCとLolEのアミノ酸配列はかなり相同性があるが、遺伝子破壊株を構築することにより、どちらのサブユニットもリポ蛋白質の遊離反応に必須であることを明らかにした。また、50種以上の大腸菌のABCトランスポーターの中で、LolCDEはMsbAと同様必須であることが判明した。遊離反応の際、LolCDEとLolA間には相互作用があることがLolA変異体の分離により初めて明らかになった。さらに、LolAからLolBにリポ蛋白質を受け渡すことができない変異体も分離した。

仅当位置2处的氨基酸残基是天冬氨酸时，脂蛋白才保持内膜。残留内膜信号起着其作用的原因是使用与LOLCDE和脂蛋白重构的蛋白脂质体一起研究了其作用。结果，据透露，具有残留内膜信号的脂蛋白不会成为LOLCDE的底物，也就是说，LOL逃避信号。另一方面，尚未确定选择信号在自由反应过程中的功能还是影响脂蛋白的脂质修饰。因此，我们构建并分析了一个实验系统，用于制备apo型脂蛋白并在体外转化为成熟的脂蛋白，并确定脂质修饰没有根据选择信号而差异，并且选择信号只会影响自由反应。当一种将脂蛋白带有信号的突变菌株被隔离在内膜中时，发现位于LOLCDE复合物（LOLC）的40位位置的丙氨酸被更改为脯氨酸。此外，我们研究了以前不可能的Lola和Lolb是否通过隔离来识别选择信号。结果，只有LOLCDE才能识别选择信号。尽管膜亚基的氨基酸序列LOLC和Lole是同源的，但通过构造基因破坏菌株，我们揭示了这两个亚基对于无脂蛋白无反应至关重要。此外，在超过50个大肠杆菌的ABC转运蛋白中，LOLCDE被发现与MSBA一样必不可少。 Lola突变体的分离首次揭示了自由反应期间Lolcde和Lola之间存在相互作用。此外，也孤立了无法将脂蛋白从萝拉传递到洛尔布的突变体。