再構成系とin vitro実験系による大腸菌蛋白質膜透過の分子機構の解析

利用重构系统和体外实验系统分析大肠杆菌蛋白膜渗透的分子机制

• 批准号: 02680153
• 负责人: 徳田 元
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1990
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1990 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02680153/
• 关键词: 蛋白質の膜透過; 再構成実験系; プロトン駆動力; 大腸菌; 海洋細菌

反転膜小胞を用いたin vitro蛋白質膜透過系において、以下の成果が得られた。1.分子内にジスルフィド結合を持った前駆体蛋白質は、大腸菌の膜を透過するためにプロトン駆動力が必須となることを見いだした。2.大腸菌の蛋白質膜透過反応において、プロトン駆動力はATPに対する親和性を高める作用を持っていることを見いだした。3.大腸菌蛋白質膜透過反応において、ATPとプロトン駆動力の役割に関してこれまでに得られた知見を総合し、モデルを提出した。4.海洋性好塩細菌Vibrio alginolyticusの反転膜小胞において、蛋白質膜透過のin vitro実験系を構築し、大腸菌のSecA蛋白質が顕著に反応を促進することを見いだした。またこの系において、プロトン駆動力ではなく、Na^+駆動力が重要であることを見いだした。大腸菌の蛋白質膜透過系の再構成実験系において、以下の成果が得られた。1.細胞質膜をオクチルグルコシドで可溶化後、希釈によってオクチルグルコシドを除きリポゾ-ムに組み込み、蛋白質の膜透過系を再構成する方法を確立した。2.SecE蛋白質を精製し、これが膜透過の必須の因子であることを明らかにした。3.Secy蛋白質を精製し、蛋白質膜透過装置の必須因子であることを証明した。また、膜透過装置の基本単位は、SecE、Secy、SecAの3者のみで構築できることを明らかにした。

The reverse 転 membrane cell を was permeated by the にお た て in vitro protein membrane, and the following <s:1> results が obtained られた. 1. The intramolecular に ジ ス ル フ ィ ド combining を hold っ た は 駆 body protein, coliform の membrane を through す る た め に プ ロ ト ン 駆 power が must と な る こ と を see い だ し た. 2. The coliform の protein membrane through the 応 に お い て, プ ロ ト ン 駆 power は ATP に す seaborne る affinity を high め る role を hold っ て い る こ と を see い だ し た. 3. The coliform protein membrane through the 応 に お い て, ATP と プ ロ ト ン 駆 power cut に の service masato し て こ れ ま で に must ら れ た knowledge を 総 し, モ デ ル を proposed し た. 4. Good sea salt bacteria Vibrio alginolyticus の reverse planning membrane vesicular に お い て, protein membrane through の in vitro be 験 を build し, coliform の SecA protein が 顕 the に anti 応 を promote す る こ と を see い だ し た. ま た こ の is に お い て, プ ロ ト ン 駆 power で は な く, Na ^ + 駆 motivation が important で あ る こ と を see い だ し た. The protein membrane of the Escherichia coli strain passes through the strain to reconstitute the experimental strain にお にお て て, and the following strain results が obtain られた. 1. The cytoplasm membrane を オ ク チ ル グ ル コ シ ド で can be melted, bush 釈 に よ っ て オ ク チ ル グ ル コ シ ド を except き リ ポ ゾ - ム に group み 込 み, protein の membrane through を then す を る method established し た. 2. For the を refinement of SecE protein and the <s:1> れが membrane permeation <e:1>, <s:1> factors である とを とを clarity ら に に に た た are essential. 3. The refining of Secy protein を and the protein membrane permeation device <s:1> must be verified by the factors である とを とを とを for <s:1> た. ま た, membrane device through basic 単 の は, SecE, Secy, SecA の 3 is の み で build で き る こ と を Ming ら か に し た.

项目成果

Mizushima,S.: "In vitro translocation of bacterial secretory proteins and energy requirements." J.Bioenerg.Biomembr.22. 389-399 (1990)

Mizushima,S.：“细菌分泌蛋白的体外易位和能量需求。”

Tokuda,H.: "In vitro protein translocation into inverted membrane vesicles prepared from Vibrio alginolyticus is stimulated by the electrochemical potential potential of Na^+ in the presence of Escherichia coll" FEBS Lett.264. 10-12 (1990)

Tokuda，H.：“在大肠杆菌存在的情况下，Na + 的电化学势能刺激从溶藻弧菌制备的体外蛋白质易位到倒置膜囊泡中”FEBS Lett.264。

Shiozuka,K.: "The proton motive force lowers the level of ATP required for the in vitro translocaion of a secretory protein in Escherichia coli." J.Biol.Chem.265. 18843-18847 (1990)

Shiozuka,K.：“质子动力降低了大肠杆菌分泌蛋白体外易位所需的 ATP 水平。”

Tokuda,H.: "Purification of SecE and reconstitution of SecEーdependent protein translocation activity." FEBS Lett.

Tokuda, H.：“SecE 的纯化和 SecE 依赖性蛋白质易位活性的重建。”

Tani,K.: "Translocation of proOmpA possessing an intramolecular disulfide bridge into membrane vesicles of Escherichia coli." J.Biol.Chem.265. 17341-17347 (1990)

Tani,K.：“具有分子内二硫键的 proOmpA 易位到大肠杆菌的膜囊泡中。”