精製標品を用いた再構成系による大腸菌蛋白質膜透過の分子機構

使用纯化制剂重构系统进行大肠杆菌蛋白膜渗透的分子机制

• 批准号: 03680164
• 负责人: 徳田 元
• 金额: $ 1.02万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1991
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1991 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03680164/
• 关键词: 蛋白質膜透過; 再構成系; 大腸菌; SecA; SecE; SecY

大腸菌の蛋白質膜透過には、SecA、SecB、SecE、SecD、SecF、SecY等の蛋白質因子が関与しているとされている。この内SecB蛋白質は、膜透過に必須ではない。一方、SecA蛋白質は膜表在性のATP分解活性を持つ必須因子である。SecD、SecE、SecF、SecY蛋白質は膜内在性の蛋白質であり、これらの機能を明らかにするためには、リポゾ-ムを用いた再構成実験系が必須である。申請者は、既にこの再構成実験系を確立し報告した。さらにSecEとSecY蛋白質をはじめて均一に迄精製することに成功し、これらを用いた本年度の研究で以下の成果を得た。(1)SecE、SecYは、いずれも必須の因子であることを精製標品を用いた再構成系がはじめて証明した。(2)SecE、SecY、SecAのみで大腸菌の蛋白質膜透過系が構築できることを明らかにした。(3)SecA蛋白質は、リポゾ-ム、前駆体蛋白質、ATP等と相互作用すると構造変化を起こすことを示した。(4)SecE蛋白質は、3カ所の膜貫通領域を持つ蛋白質である。3番目の膜貫通領域のみからなる変異SecEが機能的であることが遺伝学的に示唆されている。申請者らは、遺伝子工学的手法を用いて作成した変異SecE蛋白質を精製し、再構成を用いて、SecEの機能は3番目の膜貫通領域に集中していることを明らかにした。またこの領域がSecYと相互作用することを示した。(5)成熟体部分に電荷を持たない蛋白質の膜透過も、プロトン駆動力要求性であることを示し、蛋白質の電気泳動的移動にプロトン駆動力が必要になるのではなく、膜透過系自体がプロトン駆動力を要求することを示した。(6)蛋白質膜透過系は蛋白質/H^+アンチポ-タ-様の活性を有することを見いだした。(5)、(6)は反転膜小胞を用いて得られた結果であり、現在これらの知見を再構成系でより詳細に解析している。

The <s:1> protein membrane of escherichia coli is related to が protein factors such as に に, SecA, SecB, SecE, SecD, SecF, and SecY, and is associated with <s:1> て るとされて るとされて る る る る. The に and membrane permeation of the SecB protein in <s:1> に must be で な な な. One side, the <s:1> ATP-decomposing activity of the <s:1> membrane surface of the SecA protein を holds the essential factor である. SecD, SecE, SecF, internality の は SecY protein membrane protein で あ り, こ れ ら の function を Ming ら か に す る た め に は, リ ポ ゾ - ム を with い た form again be が 験 department must で あ る. The applicant に, that is, に を, reconstituted the laboratory を, established the research report た た. さ ら に SecE と SecY protein を は じ め て uniform に effect of refined す る こ と に successful し, こ れ ら を with い た で の below this year's の research を た. (1) the SecE, SecY は, い ず れ も must の factor で あ る こ と を refined label product を い た reconstitution is が は じ め て prove し た. (2) The protein membrane permeation system of SecE, SecY, and SecA みで escherichia coli <e:1> is が to construct で で る <s:1> とを とを とを and ら ら に た た た た た た た とを. (3) SecA protein は, リ ポ ゾ - ム, former 駆 body such as protein, ATP と interaction す る と structure - the を up こ す こ と を shown し た. (4)SecE protein を, 3カ <s:1> membrane permeation domain を hold protein である. Triple mesh の transmembrane domain の み か ら な る - different SecE が functionary で あ る こ と が but 伝 learn に in stopping さ れ て い る. Applicants ら は, but son 伝 engineering technique を い て made し た - different SecE protein を refined し and constitute を い て, SecE の function は triple mesh の transmembrane domain に concentrated し て い る こ と を Ming ら か に し た. The また た <s:1> <s:1> domain がSecYと interaction する する とを とを shows that た た. (5) mature body part に charge を hold た な い の membrane protein through も, プ ロ ト ン 駆 power requires sexual で あ る こ と を し, protein の electric 気 swimming movement に プ ロ ト ン 駆 power が necessary に な る の で は な く, membrane through a series of autologous が プ ロ ト ン 駆 power を requirements す る こ と を shown し た. (6) The protein membrane permeation system is based on the <s:1> protein /H^+ア チポ チポ-タ- similar <s:1> activity を, which includes する とを とを とを, and can be found in だ だ and た. (5) and (6) は reverse planning membrane vesicular を with い て have ら れ た results で あ り, now こ れ ら の knowledge を reconstitution is で よ り detailed analytical し に て い る.

项目成果

Kato,M.et al.: "In vitro translocation of secretory proteins possessing no charges at the mature domain takes place efficiently in a protonmotive force dependent mannar." J.Biol.Chem.267. (1992)

Kato,M.等人：“在成熟结构域不带电荷的分泌蛋白的体外易位以质子动力依赖性方式有效地发生。”

Tokuda,H.et al: "Purification of SecE and reconstitution of SecEーdependent protein translocation activity." FEBS Lett.279. 233-236 (1991)

Tokuda, H. 等人：“SecE 的纯化和 SecE 依赖性蛋白质易位活性的重建。”FEBS Lett.279（1991）。

Akimaru,J.et al.: "Reconstitution of a protein translocation system containing purified Secy,SecE and SecA of Escherichia coli." Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 88. 6545-6549 (1991)

Akimaru,J.et al.：“含有纯化的大肠杆菌 Secy、SecE 和 SecA 的蛋白质易位系统的重建。”

Shinkai,A.et al.: "The conformation of SecA,as revealed by its protease sensitivity,is altered upon interaction with ATP,presecretory proteins,everted membrane vesicles,and phospholipids." J.Biol.Chem.266. 5827-5833 (1991)

Shinkai, A. 等人：“正如其蛋白酶敏感性所揭示的那样，SecA 的构象在与 ATP、前分泌蛋白、外翻膜囊泡和磷脂相互作用时发生改变。”

Nishiyama,K.et al.: "SecY is an indispensable component of the protein secretory machinery of Escherichia coli." Biochim.Biophys.Acta. 1065. 89-97 (1991)

Nishiyama, K. 等人：“SecY 是大肠杆菌蛋白质分泌机制中不可或缺的组成部分。”