タンパクアレイを指向した新規タンパク固定化センサを用いるタンパク機能評価システム

使用面向蛋白质阵列的新型蛋白质固定传感器的蛋白质功能评估系统

• 批准号: 14011238
• 负责人: 村田 正治
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14011238/
• 关键词: 水晶振動子; バイオセンサ; 核内レセプター; 電気科学計測; プロテインチップ; 内分泌撹乱物質

ゲノム解析により多くのタンパクをコードする遺伝子が解明されつつあるが、今後は未知のタンパクの機能や変異が生命システムに及ぼす影響を迅速かつ簡便に評価することが必要になる。本研究では、多くのタンパクを基板上に固定化し、一度に評価できるシステムの開発を目指した。まず、代表的な核内転写因子であり、内分泌撹乱物質の標的タンパク質としても知られているヒトエストロゲンレセプター(hER)を固定化した電気化学素子の開発を行った。遺伝子組み換え技術によってN末端にヒスチジンタグを導入したhERリガンド結合ドメイン(hER-LBD)を大量合成した。これを末端チオール化ニトリロトリ酢酸(NTA)誘導体と金属イオンを介して結合、さらに金-チオール間の化学吸着現象を利用することによって、hER-LBD三元複合体を金薄膜上へ固定化した。レセプタータンパク質の最も重要な機能がタンパク質-タンパク質間相互作用である。そこで我々は固体電極上に固定化したレセプターのリガンド誘導的なタンパク質複合体の形成を水晶振動子(QCM)法によって観察することを試みた。hER-LBD固定化電極を測定溶液に浸積し、これに所定の濃度の天然女性ホルモン17β-エストラジオールとhERのコアクチベーターSRC-1を加えたところ17β-エストラジオール依存的に水晶振動子の重量増加が観察された。これは振動子上に固定化されたhER-LBDがリガンド結合によってコンホメーション変化しSRC-1と複合体を形成したためである。周波数変化から換算すると、水晶振動子上に固定化された5pmolのhER-LBDに、10nMという極めて低濃度の17β-エストラジオールを作用させたところ、およそ1.8pmolのSRC-1が結合したことが明らかとなった。QCM法はラベル化反応等の煩雑な操作が不要であり、タンパク質間相互作用の新しいツールとして有効である。

There are many hidden messages that need to be explained in the analysis of the system, and it is necessary to quickly and easily evaluate the functions and differences of unknown systems in the future. This study is aimed at immobilizing and evaluating the development of multi-layer substrates. In addition, the target of endocrine disruptor substances (hER) is immobilized and the development of electrochemical elements is carried out. A large number of synthesis methods were developed for the N-terminal gene transfer technology, such as hER-LBD. The terminal chemical reaction of NTA inducer with metal ions and the use of chemisorption phenomena between gold and LBD ternary complexes were immobilized on gold thin films. The most important function of the substance is the interaction between substances. The crystal oscillator (QCM) method was used to investigate the formation of the solid electrode immobilized on the substrate. Immobilized electrode of hER-LBD is used to measure the immersion of the solution, and the weight of the crystal oscillator is increased according to the concentration of the natural female crystal oscillator. This is the first time that the ER-LBD has been immobilized. The number of cycles is reduced to 5pmol of hER-LBD and 10nM of SRC-1 at low concentrations. The QCM method is a new method for solving problems such as chemical reactions.

项目成果

M.Murata: "Thermo Responsive DNA/Polymer Conjugate for Intelligent Antisense Strategy"Chemistry Letters. 23(3). 266-267 (2003)

M.Murata：“用于智能反义策略的热响应 DNA/聚合物缀合物”化学快报。

T.Anada: "Functional regulation of biomolecule using DNA-conjugation"Nucleic Acids Symp.Ser.. 2. 269-270 (2002)

T.Anada：“使用 DNA 缀合对生物分子进行功能调节”Nucleic Acids Symp.Ser. 2. 269-270 (2002)

村田正治: "レセプター固定化センサによる内分泌撹乱物質の高速センシング"資源環境対策. (印刷中).

Masaharu Murata：“使用受体固定传感器高速传感内分泌干扰物”资源和环境措施（正在出版）。

M.Murata: "A high-throughput screening assay of endocrine-disrupting chemicals using a receptor-modified Au-electrode"The Analyst. (印刷中).

M.Murata：“使用受体修饰的金电极进行内分泌干扰化学物质的高通量筛选测定”分析师（正在出版）。

N.Soh: "Affinity Precipitation Separation of DNA Binding Protein Using Block Conjugate Composed of Poly(N-isopropylacrylamide) Grafted Double-stranded DNA and Double-stranded DNA Containing a Target Sequence"Analytical Sciences. 18. 1295-1299 (2002)

N.Soh：“使用由聚（N-异丙基丙烯酰胺）接枝双链 DNA 和含有目标序列的双链 DNA 组成的嵌段缀合物对 DNA 结合蛋白进行亲和沉淀分离”分析科学。