筋分化システムに働くスプライシング因子の同定とその調節メカニズムの研究

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筋分化などの臓器の最終分化過程における劇的な細胞構造の変換には、一般に多数の分子種を効率的に変換する制御機構が必要である。本研究の目的は、筋分化システムにおける選択的スプライシングを調節する具体的なスプライシング調節因子を単離しその機能を解析することである。我々はこれまで、ATP合成酵素γサブユニット遺伝子の筋特異的な選択的スプライシングを再現するin vitro系を構築し、筋特異的なエキソン除外に働くシス配列(muscle-specific exonic splicing silencer)を同定した。本年度は、ATP合成酵素γサブユニットmRNA前駆体を基質としてin vitro splicing系やシスエレメント(MS-ESS)をプローブとしたノースウエスタン法、アフィニティカラム法などを用いて、HeLa細胞核抽出液から構成的スプライシング因子を、また筋特異的スプライシング誘導を示す酸性刺激後のHT1080細胞核抽出液から選択的スプライシング因子を精製した。さらに、これらのサンプルを二次元電気泳動法や質量分析法(TOF-MS Finger Print法)によりタンパク質の一次配列を決定し、スプライシング調節の候補トランス因子を複数同定した。それらはいずれもRNA結合モチーフを持ち、RNA結合蛋白質と予測される。現在、これらのcDNAのクローン化を試みており、これらのスプライシング調節活性をin vivo splicing系にて検定する予定である。一部cDNAの結果では、シスエレメント依存的に働く因子群と、非依存的に働く因子群とに分類できている。今後、得られたタンパク質を網羅的に解析し、筋特異的なスプライシング制御の全体像の検討を試みる予定である。