ATP合成酵素RNA前駆体における筋特異的スプライシング調節因子の研究

ATP合酶RNA前体肌肉特异性剪接调节因子的研究

• 批准号: 07250215
• 负责人: 遠藤 仁司
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Jichi Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07250215/
• 关键词: RNAスプライシング; 選択的スプライシング; スプライシング因子; 筋分化; ATP合成酵素; アイソフォーム

申請者は本研究にて筋特異的なエクソン選択の制御機構を解明するために、ミトコンドリアATP合成酵素γサブユニット遺伝子を用いて、心筋・骨格筋特異的な選択的スプライシングを制御するシス領域およびトランス因子を解明することを目的とした。1)選択的スプライシングを制御するシス領域の解析:申請者はヒト、ウシ、マウスの本遺伝子における筋特異的なアイソフォームの存在を初めて示し、それが選択的RNAスプライシングで生成されることを示した。それぞれのゲノム遺伝子の塩基配列を比較すると、エクソン選択を受ける第9エクソンの約400塩基上流に保存領域が存在した。またミニ遺伝子を作成し、このミニ遺伝子はエクソン選択の調節に必要なシス領域をすべて含むことを証明した。今後、保存領域に塩基変異を導入するなどして、調節領域を決定する予定である。2)無細胞系を用いた筋特異的スプライシング調節因子の解析:無細胞系にてスプライシング調節因子を解析するために、まず核抽出液を精製した。核抽出液はエクソンの陰性選択が行われない誘導前の細胞および低pHによりエクソン除外が行われた誘導後の細胞の各々から抽出した。保存配列を含むエクソン9の周辺領域に相当するリボプローブを用い、各々の核抽出液にてゲルシフトおよびUVクロスリンクアッセイを行った結果、誘導前の核抽出液では分子量約60kD及び100kDの蛋白がRNAに結合するが、誘導後の核抽出液をそれに加えると二つの蛋白の結合が阻害された。3)既知スプライシング因子の関与に対する検討:既知のスプライシング因子であるSF2/ASF, U2AF, PTB, SR蛋白などに対する抗体を用いてウエスタンブロット法にて、各々の核抽出液を検討した。その結果、蛋白量に大きな変化は認められなかったので、これらのスプライシング因子は、本遺伝子の選択的スプライシングの調節蛋白ではないと考えられた。4)筋特異的RNA結合蛋白の部分cDNAクローニング:またdegenerate primerを用いたPCRにて筋特異的なRRM型RNA結合蛋白の遺伝子断片をクローニングした。現在、全長cDNAをクローニング中である。

Applicants は this study に て muscle specific な エ ク ソ ン sentaku の system royal institution を interpret す る た め に, ミ ト コ ン ド リ ア ATP synthetase gamma サ ブ ユ ニ ッ ト heritage 伝 son を with い て, heart muscle, skeletal muscle specific な sentaku of ス プ ラ イ シ ン グ を suppression す る シ ス field お よ び ト ラ ン ス factor を interpret す る こ と を purpose と し た. 1) sentaku ス プ ラ イ シ ン グ を suppression す る シ の ス field analytic: applicants は ヒ ト, ウ シ, マ ウ ス の this heritage 伝 son に お け る muscle specific な ア イ ソ フ ォ ー ム の is early を め て し, そ れ が sentaku RNA ス プ ラ イ シ ン グ で generated さ れ る こ と を shown し た. そ れ ぞ れ の ゲ ノ ム posthumous son 伝 の salt base with column を compare す る と, エ ク ソ ン sentaku を by け る 9 エ ク ソ ン の about 400 salt base upper に preservation areas exist が し た. ま た ミ ニ heritage 伝 を し consummate, こ の ミ ニ posthumous son 伝 は エ ク ソ ン sentaku の adjusting に necessary な シ ス field を す べ て containing む こ と を prove し た. In the future, the preservation domain に base variation を will be introduced into するな and <s:1> て て, and the regulation domain を will determine する and である. 2) no cell line を with い た muscle specific ス プ ラ イ シ ン グ adjustment factor の analytic: no cell line に て ス プ ラ イ シ ン グ adjustment factor analytical す を る た め に, ま ず nuclear extract を refined し た. Nuclear extract は エ ク ソ ン の negative sentaku が line わ れ な い induced の cells before お よ び low pH に よ り エ ク ソ line except ン が わ れ た の cells after induction の each 々 か ら spare し た. Save with column を containing む エ ク ソ ン の 9 weeks 辺 field に quite す る リ ボ プ ロ ー ブ を い, each 々 の nuclear extract に て ゲ ル シ フ ト お よ び UV ク ロ ス リ ン ク ア ッ セ イ を line っ た results, inducing the former の nuclear extract で は molecular weight about 60 kd and 100 kd protein の が び RNA に combining す る が, after induction の nuclear extract を そ れ に added Youdaoplaceholder0 2 えると <s:1> protein <e:1> binds to が and hinders された. 3) both know ス プ ラ イ シ ン グ factor の masato and に す seaborne る 検 beg: both know の ス プ ラ イ シ ン グ factor で あ る SF2 / ASF, U2AF, PTB, SR protein な ど に す seaborne を る antibody with い て ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト method に て, various 々 の nuclear extract を beg し 検 た. そ の に large amount of results, protein き な variations change は recognize め ら れ な か っ た の で, こ れ ら の ス プ ラ イ シ ン グ factor は, this legacy 伝 son の sentaku of ス プ ラ イ シ ン グ の regulatory proteins で は な い と exam え ら れ た. Part 4) muscle specific RNA binding protein の cDNA ク ロ ー ニ ン グ : ま た degenerate primer を with い た PCR に て muscle specific な type RRM RNA binding protein の heritage 伝 son fragment を ク ロ ー ニ ン グ し た. Now, in the full-length cDNAを ロ ロ ニ ニ グ グ.

项目成果

遠藤仁司: "Gene structure and cell type-specific expression of the human ATP synthase α subunit." Biochem, Biophys. Acta. 1219. 129-140 (1994)

Hitoshi Endo：“人类 ATP 合酶 α 亚基的基因结构和细胞类型特异性表达。”Biochem，Biophys。1219。129-140（1994）

遠藤仁司: "Heart/muscle-specific alternative splicing ATP synthase γ-subunit pre-mRNA during muscle development." Cardiac Development and Geno Regulation Ed. by Y. Yazaki. 77-97 (1995)

Hitoshi Endo：“肌肉发育过程中心脏/肌肉特异性选择性剪接 ATP 合酶 γ 亚基前体 mRNA”，Y. Yazaki 编着，77-97。

遠藤仁司: "Gene of heat shock protein of sulfur-dependent archaeal hyperthermophile Desul furococcus." Biochem. Biophys. Res. Commun.214. 730-736 (1995)

Hitoshi Endo：“硫依赖性超嗜热球菌 Desul Biochem 的热休克蛋白基因。生物化学研究 730-736”。

遠藤仁司: "Exclusion of an alternatively spliced exon in mitochondrial ATP synthase γ-subunit pre-mRNA requires de novo protein synthesis." J. Biol. Chem.269. 12488-12493 (1994)

Hitoshi Endo：“线粒体 ATP 合酶 γ 亚基前体 mRNA 中的选择性剪接外显子的排除需要从头合成蛋白质。”J. Biol. 12488-12493 (1994)。

遠藤仁司: "A candidate gene for RNA export carrier protein has two RBDs (RNA binding domain and Ran binding domain)." Nucleic Acid Symp. Series. 33. 31-32 (1995)

Hitoshi Endo：“RNA 输出载体蛋白的候选基因具有两个 RBD（RNA 结合域和 Ran 结合域）。” 33. 31-32 (1995)。