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タンパク質に新たに見出された結び目構造のフォールディング機構の解明

阐明蛋白质中新发现的结结构的折叠机制

基本信息

批准号：
15032209
负责人：
濡木理
金额：
$ 3.26万
依托单位：
Tokyo Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

タンパク質は、リボソームでポリペプチドとして合成された後、自発的にあるいはシャペロンの力を借りて正しくフォールディングすることにより、機能を獲得する。申請者らは、まずタンパク質合成に必須なtRNAのアミノ酸受容末端である3'CCA末端の合成・修復に働くCCA付加酵素とtRNAプライマーと新たに結合すべきATPの複合体のX線結晶構造解析を行い、CCA付加酵素がいかにDNAの鋳型なくして特定の配列のRNAを重合できるのかを世界にさきがけて解明した(Nature,2004)。さらに、申請者らは、リボソームRNAおよびtRNAのメチル化修飾に携わるSpoUファミリーメチル基転移酵素(それぞれRrmA、TrmH)が、その触媒ドメインに特徴的な結び目(knot)構造を持つこと、そのknot構造は、触媒部位の構築、メチル基供与体(S-アデノシルメチオニン)の結合部位の構築、分子の2量化を介するRNA依存的メチル基転移反応に働いていることを明らかにした(Structue,2004)。これらメチル基転移酵素のknot構造がどのようにフォールディングし形成されるのかを解明するため、TrmHに様々な変異を導入した結果、knotよりC末端側に変異を導入するとknotが巻かなくなることから、C末端側のペプチド部分がループをくぐって結び目ができることがわかった。さらに、TrmHの変性実験を行ったところ、尿素では変性せず、5Mグアニジン塩酸で変性するものの、10ms以内に準安定な状態(約半分の2次構造が復活した状態)になり、そこから約8時間という長い過程を経て、もとのknot構造に巻き戻り、活性も回復することが明らかになった。さらに、TrmHがknotを巻くとN末端ヘリックスとC末端ヘリックスが寄り合うことを利用し、N末端のヘリックス中に存在するArg17をCysに置換し、これをIAEDANCEで標識し、C末端ヘリックス上のTrp191によって励起された結果のFRETを観測する事で、変性状態から巻き戻る過程を経時的に観測した。その結果、経時的にFRETが上昇し、TrmHがknotを巻く過程を視覚化する事に初めて成功した(論文準備中)。

The quality of the product is high, and the product is easy to produce. The applicant has performed X-ray crystallographic analysis of the complex of TRNA binding to ATP, CCA enzyme binding to DNA and RNA binding to a specific ligand, and DNA binding to the 3'CCA terminal (Nature,2004). In addition, the applicant may also respond to the request for a SpoU gene transfer enzyme by modifying the RNA and tRNA sequences.(For example, RrmA, TrmH), the structure of the knot, the structure of the catalyst site, the structure of the binding site of the S-donor, the molecular quantization, the RNA-dependent base shift, etc.)(Structure,2004). The structure of the knot-like enzyme is changed from the first to the second. The result is that the knot-like enzyme is changed from the second to the third. In addition, TrmH's property is changed, 5M is lost, and the quasi-stable state is within 10ms (about half of the second structure is restored). In addition, TrmH can be knotted, N terminal can be removed, C terminal can be removed, Arg17 can be replaced, IAEDANCE can be identified, C terminal can be removed, FRET can be detected, and the state of change can be detected. The results, the time of FRET rise, TrmH knot, the process of visualization, the beginning of success (paper preparation)

项目成果

期刊论文数量（30）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Crystallization and preliminary X-ray analysis of the helicase domains of Vasa complexed with RNA and an ATP analogue.

Vasa 与 RNA 和 ATP 类似物复合的解旋酶结构域的结晶和初步 X 射线分析。

DOI：
发表时间：
2004
期刊：
Acta Crystallographica D 60
影响因子：
0
作者：
Tanaka A.;Konno M.;Muto S.;Kambe N.;Morii E.;Nakahata T.;Itai A.;Matsuda H.;T.Sengoku
通讯作者：
T.Sengoku

Structural basis for template-independent RNA polymerization