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X線結晶構造解析によるアミノアシルtRNA合成酵素の反応機構の解明

X射线晶体结构分析阐明氨酰-tRNA合成酶的反应机制

基本信息

批准号：
08780612
负责人：
濡木理
金额：
$ 0.64万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1。高度好熱菌由来イソロイシルtRNA合成酵素(IleRS)のX線結晶構造解析我々はすでに高度好熱菌IleRSの結晶化(単斜晶系C2:a=160Å,b=95Å,c=128Å,b=128Å)に成功していたが、この結晶の水銀化合物置換体、メチオニンをセレノメチオニルに置換したIleRS、イソロイシルAMPのヨード化アナログを結合させた置換体、新たにシステイン残基を導入した変異体IleRSの水銀置換体を用いて、重原子同型置換法により位相決定に成功し、2.8Å分解能での構造を決定することに成功した。高度好熱菌IleRSは、Rossmann foldを含む触媒ドメイン、それに挿入されたβシート構造に富むCP-1およびCP-2ドメイン、tRNAのアンチコドンを認識するα-helix bundleから成るドメインの計4ドメインが緊密に結合して、rigidなL字型構造をとっていた。近縁なMetRS(大腸菌由来)と比較すると、触媒ドメインおよびC端側のα-helix bundleドメインは構造が非常に良く似ているのに対し、CP-1およびCP-2ドメインは構造が全く異なっていた。このCP-1およびCP-2ドメインは、興味深いことに4つのシステイン残基からなる新規のタイプのzinc fingerを持ち、それぞれZn2+イオンを結合していた。IleRSとtRNAIleのドッキングモデルを作成したところ、CP-1ドメインの根本のZn2+イオンは、tRNAIleのアクセプターステムに近接しており、アクセプターステムの認識に寄与していることが示唆された。さらに、このIleRSの結晶にイソロイシンをsoakingしたところ、触媒部位周辺でイソロイシンに対応する電子密度が見いだされた。基質であるイソロイシンの疎水性側鎖は、ProムおよびTrp558によってvan der Waals相互作用による認識を受けていると考えられる。2。高度好熱菌由来きバリルtRNA合成酵素(ValRS)およびアルギニルtRNA合成酵素(ArgRS)の結晶構造解析高度好熱菌からValRSおよびArgRSの遺伝子をクローニングし、大腸菌での大量発現系の構築に成功した。高純度に精製されたValRSおよびArgRSを用いて結晶化のスクリーニングを行ったところ、予備的ではあるがいずれも結晶の作成に成功した。このうち、ArgRSに関してはRaxisIVにより回折強度を測定したところ、六方晶系に属し分解能は4Å程度の結晶であることがわかった。現在、これら酵素単独の結晶化条件の改良を進めている。さらに、いずれの系においても特異的なtRNAをT7 RNA ,polymeraseを用いてin vitroで調製し、酵素との複合体の結晶化を試みている。またアミノ酸配列を決定した結果、高度好熱菌のValRSはIleRSと同様、触媒ドメインに挿入されたCP-1およびCP-2ドメインにIleRSと良く似たzinc fingerを持っており、ValRSの構造解析を行いIleRSと比較することは、酵素の分子進化機構を探る上で極めて重要であると考えられる。

1。highly pathogenic bacteria, such as TRNA synthase, X-ray Crystal Structure Analysis of (IleRS)(monoclinic system C2:a=160 ° C,b=95 ° C,c=128 ° C,b=128 ° C),b = The phase determination and the structure determination of the heavy atom homotypic substitution method were successfully carried out by the method of heavy atom homotypic substitution, and the structure determination of the heavy atom homotypic substitution method was successfully carried out. Highly resistant bacteria IleRS fold, Rossmann fold, contain catalyst elements, rigid elements, beta element structure, rich CP-1 and CP-2 elements, tRNA and loss element structure, α-helix bundle structure, rigid element structure, tight element structure, rigid L element structure. MetRS(Coliform origin) is very similar to CP-1 and CP-2 in structure. The CP-1 and CP-2 residues are very interesting. The zinc finger of the new regulation is very complex. The Zn2+ residues are very complex. IleRS and tRNAIle's base station are formed in the following ways: 1. The base station of CP-1 base station is Zn2+; 2. The base station of tRNAIle is close to the base station; 3. The base station of tRNAIle is close to the base station. The electron density of the crystal solution of IleRS is very high. The interaction between the matrix and van der Waals was studied. 2。The crystal structure analysis of ValRS and ArgRS from highly pathogenic bacteria was successfully constructed. High purity, high purity RaxisIV, RaxisIV Now, the improvement of crystallization conditions for enzyme isolation has been carried out. In addition, in the middle of the system, specific tRNA, T7 RNA ,polymerase are used to modulate in vitro, and crystallization of enzyme complexes is attempted. The results of acid alignment determination, high temperature bacteria ValRS IleRS identity, catalyst, catalyst, and zinc finger analysis of IleRS are extremely important.