機能性脂質ドメイン(ラフト)におけるコレステロールとタンパク質の相互作用の解析

功能性脂质域（筏）中胆固醇和蛋白质之间相互作用的分析

基本信息

批准号：
16048209
负责人：
片平正人
金额：
$ 2.37万
依托单位：
Yokohama National University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16048209/
关键词：
ラフトコレステロール毒素 Perfringolysin 0 生体膜立体構造 NMR タンパク質

项目摘要

我々はプロテアーゼによる限定分解と化学修飾を施して無毒化したPFOタンパク質が、ラフトを検出するプローブとして利用できる事を見出した。さらにPFOタンパク質中の約110アミノ酸からなる部位(D4)が、ラフト中のコレステロールへの選択的な結合能を有する事が分かった。これまでD4は、大腸菌で大量発現させ、菌体破砕後の可溶性画分から調製していた。今回不溶性画分から大量に調製する方法を確立した。TritonX-100で洗浄し、グアニジンで可溶化し、ここにアルギニンを加えた。これを透析してグアニジン濃度を下げる事でリフォールディングを行った。得られたD4は従来の方法で調製したものと同様のCDスペクトルを与えた。^<13>C,^<15>N2重標識したD4を同様の手法で調製し、現在3重共鳴NMR法による共鳴線の帰属を進行させているところである。次に膜環境を模した状態における構造解析を行う為に、D4をミセルに取り込ませる事を試みた。各種のdetergentを試みた結果、DPCが最も良好な結果を与えた。この状態におけるCDスペクトルは、水中におけるものとは少し異なっていた。さらにより膜の環境に近づける為に、コレステロール含有のリポソームを調製し、そこにD4を取り込ませた。この状態のCDスペクトルも、水中におけるものとは少し異なっていた。今後はこの系に転移交差飽和法を適用する事によって、D4とコレステロール及びD4と脂質の相互作用様式を同定できると考えられる。タンパク質とリガンドの複合体の構造決定及び水素結合の同定手法の開発等も行なったが、これらの技術は、今後膜結合に伴うPFOタンパク質の構造変化及びコレステロール・脂質との結合様式の原子レベルの分解能での解明に利用できる。

我们发现，可以将降解有限的排毒PFO蛋白用作蛋白酶的化学修饰，可以用作检测筏的探针。此外，发现PFO蛋白中约110个氨基酸的位点（D4）具有选择性结合能力的抗laft胆固醇。到目前为止，D4在大肠杆菌中大量表达，并在细胞中断后从可溶性部分制备。我们已经建立了一种准备大量不溶性部分的方法。用tritonx-100洗涤，用鸟选择素溶解，然后将精氨酸添加到其上。将其透析以降低鸟选择素的浓度以进行重折叠。所得的D4给出了与常规方法制备的CD频谱相似。 ^<13> c，^<15> N2标记的D4是使用相同方法制备的，并且目前正在执行通过三重共振NMR分配共振线。接下来，我们试图将D4纳入胶束中，以在模拟膜环境的状态下进行结构分析。尝试各种检测器后，DPC给出了最佳结果。该状态的CD光谱与水中的CD光谱略有不同。此外，要接近膜环境，制备了含胆固醇的脂质体，并在其中掺入了D4。这种情况的CD光谱也与水中的CD光谱略有不同。人们认为，可以通过将换位交叉饱和方法应用于该系统，将来，D4和胆固醇和D4之间的相互作用模式可以识别。该公司还开发了确定蛋白质配体复合物结构和鉴定氢键的方法，将来可以使用这些技术来阐明与膜结合和胆固醇/脂质在原子水平分辨率下的胆固醇/脂质结合模式相关的结构变化。