ラフトのコレステロールに結合するPFOタンパク質の構造遷移と相互作用様式の解明

阐明筏中与胆固醇结合的 PFO 蛋白的结构转变和相互作用模式

• 批准号: 17048009
• 负责人: 片平 正人
• 金额: $ 4.1万
• 依托单位: Yokohama City University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17048009/
• 关键词: ラフト; PFOタンパク質; コレステロール; NMR; 構造; リポソーム; イオンチャネル; 核酸; 生体分子; 生物物理; 蛋白質; 立体構造; 膜

PFOタンパク質を用いたラフトの細分化及び構造解析に向けた試料調製の改良従来「ラフト画分」として用いられてきた界面活性剤に不溶性の低密度膜画分から、コレステロール含有率の高い膜サブセットを分離する手法を確立した。この手法を用いてJurkat細胞から分離したBC-PFO結合性のラフト膜サブセットには、フロチリン、ガングリオシドGM1等のラフトマーカー分子の他に、Lck, LAT, PAG等のT細胞情報伝達を正・負に制御する分子群が検出された。一方、受容体刺激による活性化に伴って、BC-PFO結合性の膜領域に移行してくる分子の存在も明らかになった。PFOタンパク質の構造及びコレステロール・脂質との相互作用様式の解析を、ドメイン4(D4)を用いて進行させた。大腸菌の菌体破砕液の不溶性画分に存在するD4を、アルギニン法によってリフォールディングする事で、これまでに100FMの濃度のD4試料を安定して調製できるようになっていた。今回さらに試料調製法の改良(凝集防止剤(本領域の群馬大学・若松先生よりご提供)の添加、リフォールディング・濃縮工程の修正、サンプル管のシリコン加工等)を行った結果、500μMの濃度のD4試料を得る事に成功した。タンパク質の安定性に関しても、調製されたタンパク質はこれまで数時間程度しか良好なスペクトルを与えなかったが、今回それを1週間程度まで伸ばす事に成功した。現在この試料を用いて3次元スペクトルの測定を行い、主鎖の帰属を進行させている。

改进了使用PFO蛋白A A A方法进行筏细分和结构分析的样品制备方法，该方法已经建立了将胆固醇含量高的膜亚群与低密度膜级分离的膜亚群，这些膜含量不溶于表面活性剂，这些表面活性剂先前已被用作“ RAFT馏分”。除了筏标志物分子（例如植物基因蛋白和神经节苷脂GM1）外，在BC-PFO结合的筏膜子集中从jurkat细胞中分离出了积极和负调控T细胞信号传导的分子，例如LCK，LAT和PAG。另一方面，还揭示了通过受体刺激激活迁移到BC-PFO结合膜区域的分子的存在。使用结构域4（D4）进行了PFO蛋白结构和与胆固醇/脂质的相互作用模式的分析。通过将D4重新折叠（使用精氨酸法的大肠杆菌细胞粉碎溶液的不溶部分中存在），可以稳定地制备以100 FM浓度的D4样品。这次，我们进一步改善了样品制备方法（添加聚集抑制剂（由Gunma University的Wakamatsu教授提供），纠正重新折叠和浓度过程，硅化样品管等），因此，我们能够以500μm的浓度获得D4样品。关于蛋白质稳定性，到目前为止，制备的蛋白质仅具有大约几个小时的良好光谱，但是这次它们能够将其扩展到大约一周。当前，该样本用于测量3D光谱，分配主链正在进行中。

项目成果

Structure of human telomeric DNA under physiological ionic conditions stabilized by proper incorporation of 8-bromoguanosines, as determined by NMR

通过 NMR 测定，通过适当掺入 8-溴鸟苷而稳定生理离子条件下的人端粒 DNA 结构

• 发表时间: 2007
• 期刊: FEBS J (印刷中)
• 作者: Matsugami;M他
• 通讯作者: M他

Unichrom, a novel nuclear matrix protein, binds to the Ars insulator and canonical MARs

Unichrom 是一种新型核基质蛋白，可与 Ars 绝缘体和典型 MAR 结合

• 发表时间: 2006
• 期刊: Zoological Science 23
• 作者: Tagashira;H他
• 通讯作者: H他

a novel nuclear matrix protein, binds to the Ars insulator and canonical MARs

一种新型核基质蛋白，与 Ars 绝缘体和典型 MAR 结合

• 发表时间: 2006
• 期刊: Zoological science 23
• 作者: Tagashira;H.;Shimotori;T.;Sakamoto;N.;Katahira;M.;Miyanoiri;Y.;Yamamoto;T.;Mitsunaga-Nakatsubo;K.;Kusunoki;S.;Akasaka;K.;Unichrom
• 通讯作者: Unichrom

Molecular mechanism for maintenance of G-rich short tandem repeats capable of adopting G4 DNA structures

维持能够采用G4 DNA结构的富含G的短串联重复序列的分子机制

• 发表时间: 2006
• 期刊: Mutat. Res 598
• 作者: Nakagama;H他
• 通讯作者: H他

H., Unfolding T higher DNA structures formed by the d(CGG) triplet repeat by UP1 protein

H.，通过 UP1 蛋白展开由 d(CGG) 三联体重复形成的 T 更高 DNA 结构

• 发表时间: 2005
• 期刊: Genes Cells 10
• 作者: Fukuda;H.;Katahira;M.;Tanaka;E.;Enokizono;Y.;Tsuchiya;N.;Higuchi;K.;Nagao;M.;Nakagama
• 通讯作者: Nakagama